王棟梁，龐全海

(1.山西朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，036002；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，030801)

鋅(Zn)是人和動(dòng)物主要的微量元素之一，參與許多輔酶的構(gòu)成，在智力發(fā)育、生長(zhǎng)和維持機(jī)體免疫功能方面具有重要作用，參與體內(nèi)各類物質(zhì)的代謝。目前，鋅的營(yíng)養(yǎng)研究多限于鼠、禽和豬，而納米ZnO 的研究也只是在仔豬上的初步探討，以家兔為研究對(duì)象報(bào)道較少。本研究目的是探索日糧中添加不同水平的納米ZnO 對(duì)幼兔生長(zhǎng)性能和腸道免疫的影響，以期為幼兔納米ZnO 需求量的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣本

本研究以40 日齡幼兔為研究對(duì)象，采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，選擇日齡，體重基本一致的幼兔36 只，隨機(jī)分為4 個(gè)處理組，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3 只幼兔。試驗(yàn)期進(jìn)行42天。采用spss11.5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和組間LSD 多重比較。納米ZnO：30nm，由山西豐海納米有限公司提供。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1.2 飼糧配制

表2 基礎(chǔ)日糧配方和營(yíng)養(yǎng)水平

2 測(cè)定指標(biāo)

2.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)

2.1.1 平均日增重(ADG)：幼兔于試驗(yàn)第0、第42 天早晨8∶00空腹單個(gè)稱重。計(jì)算日增重(ADG)。

ADG =(試驗(yàn)?zāi)┢骄w重－試驗(yàn)初平均體重)/試驗(yàn)天數(shù)。

2.1.2 平均日采食量(ADFI)：以重復(fù)為單位每天結(jié)算采食量。

ADFI＝(配料總數(shù)－所剩飼料量)/試驗(yàn)天數(shù)×每組試驗(yàn)兔數(shù)。

2.1.3 料肉比(F/G)：根據(jù)日增重和日采食量計(jì)算F/G。F/G＝日采食量/日增重

2.2 組織學(xué)檢查

2.2.1 取材

試驗(yàn)期完畢后，剖殺幼兔，分別取3-5cm 十二指腸、空腸和回腸，用生理鹽水涮清洗內(nèi)容物，每段分為3 份，依次浸入Bouins 氏固定液、4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1mol/L，PH7.4)、Carnoy 液(作石蠟切片)中。

2.2.2 光學(xué)顯微鏡觀察

①石蠟切片的制作。

②常規(guī)HE 染色，顯示小腸黏膜結(jié)構(gòu)、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞。

③PAS 染色法，顯示小腸上皮表面的糖蛋白(細(xì)胞衣)、杯狀細(xì)胞。

④觀察與測(cè)量 應(yīng)用OLMPLUS 病理圖像系統(tǒng)和照相軟件，測(cè)量小腸的腸壁厚度、黏膜厚度、絨毛高度和隱窩深度。分別取5 張切片，選取10 根最長(zhǎng)腸絨毛的長(zhǎng)度、最深隱窩深度和最厚黏膜厚度以及最厚腸壁厚度，應(yīng)用spss 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和組間LSD 多重比較。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示。

3 結(jié)果

3.1 幼兔生長(zhǎng)性能的結(jié)果

在整個(gè)試驗(yàn)期幼兔無(wú)死亡，生產(chǎn)性能指標(biāo)見(jiàn)表3。

3.1.1 試驗(yàn)二組日增重高于其它三個(gè)組，其與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，日增重提高12%；與試驗(yàn)一組和試驗(yàn)三組相比沒(méi)有明顯差異(P＞0.05)，日增重提高6%和5%。

3.1.2 添加納米ZnO 可以提高幼兔的日采食量，但是各組之間差異不顯著。

3.1.3 添加納米ZnO 后，試驗(yàn)二組的料肉比與對(duì)照組、試驗(yàn)三組差異顯著，飼料效率分別改善5%和4%(P＜0.05)，其它組差異均不顯著(P＞0.05)。

3.1.4 添加不同水平納米ZnO 后，試驗(yàn)二組的的最終體重與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)，其它組差異均不顯著(P＞0.05)。

表3 不同水平納米ZnO 對(duì)幼兔生產(chǎn)性能的影響

3.2 腸黏膜的上皮形態(tài)學(xué)變化

3.2.1 腸黏膜上皮的光學(xué)顯微鏡鏡觀察光鏡觀察顯示，小腸橫斷面上具有3～5 個(gè)皺襞，每個(gè)皺襞上分布10～20 根腸絨毛。試驗(yàn)組幼兔的小腸結(jié)構(gòu)較完整，層次清晰，腸黏膜表面的紋狀緣結(jié)構(gòu)分明，腸絨毛排列整齊致密。腸黏膜上皮細(xì)胞排列緊密，染色分明。柱狀細(xì)胞胞漿豐富，胞核呈橢圓形，位于細(xì)胞基部。杯狀細(xì)胞為高腳杯狀，呈粉紅色，分布于柱狀細(xì)胞之間。各試驗(yàn)組十二指腸和空腸黏膜主要不同點(diǎn)在于25mg/kg 的納米ZnO 組的腸絨毛最為粗壯，細(xì)胞衣更厚，試驗(yàn)一組和試驗(yàn)三組次之，對(duì)照組的腸絨毛最細(xì)，且腸絨毛排列不整齊，多處腸絨毛頂端有脫落現(xiàn)象，細(xì)胞衣較薄。

3.2.2 小腸腸壁厚度、黏膜厚度、絨毛長(zhǎng)度、和絨毛長(zhǎng)度/腺窩深比值

表4 各組幼兔十二指腸和回腸壁厚度、黏膜厚度、絨毛長(zhǎng)度、和絨毛長(zhǎng)度/腺窩深比值(X±S)

飼料添加不同水平的納米ZnO 對(duì)幼兔小腸的腸壁厚度、黏膜厚度、絨毛長(zhǎng)度及絨毛長(zhǎng)度/腺窩深比值的影響分別見(jiàn)表4和圖1。各試驗(yàn)組的小腸絨毛排列整齊、致密，其中以試驗(yàn)二組的最為顯著。例如，試驗(yàn)二組的十二指腸、空腸、回腸的絨毛長(zhǎng)度分別為739.6±40.7μm、488.1±68.6μm，十二指腸的腸絨毛比空腸的長(zhǎng)，如表1-3 和圖1-1 所見(jiàn)，納米ZnO 對(duì)幼兔腸壁厚度、黏膜厚度、絨毛長(zhǎng)度略高于對(duì)照組，差異不顯著，但試驗(yàn)二組的絨毛長(zhǎng)度/腺窩深比值(V/C)明顯高于對(duì)照組，十二指腸和空腸各約增加了41%、50%。

圖1 不同水平的納米ZnO 對(duì)幼兔十二指腸和空腸結(jié)構(gòu)的影響

3.3 黏膜相關(guān)免疫細(xì)胞

3.3.1 小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞

HE 染色結(jié)果可知，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞為一群特殊淋巴細(xì)胞，散在分布于腸絨毛上皮細(xì)胞之間，大部分位于小腸上皮細(xì)胞基側(cè)膜附近，少量分布于上皮核層和頂層，固有層內(nèi)也有淋巴細(xì)胞分布。以小型細(xì)胞為主，胞核大且圓，色染較深，胞漿少。

不同試驗(yàn)組同一腸段的小腸的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的分布有差異顯著(表5 和圖2)。試驗(yàn)二組的的十二指腸上皮淋巴細(xì)胞最多，每100 個(gè)柱狀細(xì)胞之間含有上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞40.8±5.9 個(gè)，與對(duì)照組的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞比較差異顯著(P＜0.05)；試驗(yàn)一組和試驗(yàn)三組每100 個(gè)柱狀細(xì)胞之間上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞分別有37.2±4.0、34.6±3.8 個(gè)，對(duì)照組的最少，有32.4±3.0個(gè)?；啬c和空腸的結(jié)果類似于十二指腸，試驗(yàn)二組的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量增加明顯，與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)；其余各組之間差異不顯著(P＞0.05)。

表5 各組幼兔小腸黏膜IEL 的數(shù)量(IEL 個(gè)/100 柱狀細(xì)胞)

圖2 不同水平納米ZnO 對(duì)幼兔小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響

3.3.2 腸黏膜杯狀細(xì)胞

杯狀細(xì)胞分布于柱狀細(xì)胞間，多集中分布于腸腺，排列緊密。PAS 染色，杯狀細(xì)胞為高腳杯狀，呈紫紅色。

表6 各組小腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量(個(gè)/100 柱狀細(xì)胞)

由表6 可知，從十二指腸到回腸，杯狀細(xì)胞逐漸增加，約增加36%～65%。同一腸段，試驗(yàn)二組的杯狀細(xì)胞數(shù)量最多。試驗(yàn)一組和試驗(yàn)三組的杯狀細(xì)胞略高于對(duì)照組。比如，試驗(yàn)二組幼兔腸黏膜每100 個(gè)柱狀細(xì)胞含杯狀細(xì)胞數(shù)為6.6±1.5 (十二指腸)、7.2±1.9 (空腸)。明顯高于對(duì)照組，3.4±1.1 (十二指腸)、4.2±1.3(空腸)。試驗(yàn)一組又略高于試驗(yàn)三組。

圖3 不同水平納米ZnO 對(duì)幼兔小腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

4 分析與討論

結(jié)果表明：給40 日齡的幼兔飼喂納米ZnO 后，能改善料肉比、提高日增重，尤其是添加25mg/kg 的納米ZnO 組，其幼兔的日增重和料肉比明顯好于對(duì)照組，飼料改善率達(dá)5%，差異顯著(P＜0.05)。由本實(shí)驗(yàn)可知，實(shí)驗(yàn)二組幼兔的小腸黏膜上皮完整，腸絨毛健壯。這表明25mg/kg 納米ZnO 飼料可以促進(jìn)幼兔的小腸吸收，保持小腸黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，且好于10mg/kg 和50mg/kg 的納米ZnO。25mg/kg 的納米ZnO 組幼兔的絨毛長(zhǎng)度明顯高于對(duì)照組，而50mg/kg 納米ZnO 組兔的絨毛長(zhǎng)度有縮短的趨勢(shì)(圖1-1)，這也與前面生長(zhǎng)性能指標(biāo)的結(jié)果相一致，上述結(jié)果表明25mg/kg 納米ZnO 可以增加小腸腸絨毛的表面積，促進(jìn)的消化吸收，改善黏膜結(jié)構(gòu)。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼料中添加25mg/kg 的納米ZnO 后，增加了幼兔小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和腸黏膜杯狀細(xì)胞的數(shù)量，與對(duì)照組相比，在十二指腸試驗(yàn)二組的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)增加了26%；在回腸，杯狀細(xì)胞數(shù)增加了61%。上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞是黏膜免疫系統(tǒng)中首先接觸抗原的免疫活性細(xì)胞，是特殊的淋巴細(xì)胞群。其參與免疫反應(yīng)，通過(guò)偽足接觸上皮細(xì)胞，加快上皮細(xì)胞的再生，是重要的腸黏膜免疫屏障作用。杯狀細(xì)胞分泌粘液，可以保護(hù)腸黏膜，是構(gòu)成腸道機(jī)械屏障的結(jié)構(gòu)之一。其中25mg/kg的納米ZnO 效果更為明顯。

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