唐爽爽， 劉志恒*， 余朝閣， 鄭 川， 安 心， 李健冰， 趙廷昌

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110866；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京100193)

遼寧省西瓜炭疽病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究

唐爽爽1， 劉志恒1*， 余朝閣1， 鄭 川1， 安 心1， 李健冰1， 趙廷昌2

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110866；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京100193)

針對(duì)西瓜炭疽病病原菌進(jìn)行了鑒定及其生物學(xué)特性研究。通過病原菌形態(tài)學(xué)鑒定，柯赫氏法則證病，rDNA-ITS測(cè)序，鑒定該病致病菌為瓜類炭疽菌(Colletotrichumorbiculare)。生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明：病菌菌絲生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基為PSA；最適碳、氮源分別為蔗糖和NH4Cl；最適溫度為25 ℃；最適pH為6；黑暗條件利于病菌生長(zhǎng)。病菌產(chǎn)孢最適培養(yǎng)基為西瓜莖葉煎汁培養(yǎng)基；最適碳、氮源分別為蔗糖和(NH4)2SO4；最適溫度為25 ℃；最適pH為6；黑暗條件利于孢子產(chǎn)生。菌絲致死溫度為55 ℃，10 min；分生孢子致死溫度為52 ℃，10 min。

西瓜炭疽?。?瓜類炭疽菌； 鑒定； rDNA-ITS測(cè)序； 生物學(xué)特性

西瓜[Citrulluslanatus(Thunb.)Matsum.etNakai]為葫蘆科西瓜屬一年生蔓生草本植物。其果瓤脆多汁，堪稱“瓜中之王”。

西瓜炭疽病由瓜類炭疽菌[Colletotrichumorbiculare(Berk.etMont.) Arx]引起[1]。西瓜炭疽病在全世界西瓜產(chǎn)區(qū)幾乎均有發(fā)生，以濕潤(rùn)地區(qū)較為普遍。在我國(guó)遼寧省西瓜生產(chǎn)上，病害的影響歷年均居高不下，其中炭疽病的危害尤為嚴(yán)重。

關(guān)于西瓜炭疽病的發(fā)生癥狀、防治方法資料上較常見報(bào)道，但在國(guó)內(nèi)對(duì)西瓜炭疽病病原菌生物學(xué)特性的研究少見報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)西瓜炭疽病病原菌生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，以期為病害的發(fā)生規(guī)律及其綜合防治等深入研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及病原菌分離

西瓜炭疽病標(biāo)樣于2012年8月采于沈陽新民市、營(yíng)口蓋州市和阜新彰武縣。按常規(guī)組織分離方法[2]、純化及單孢分離獲得病菌純培養(yǎng)，供鑒定和生物學(xué)特性研究。

1.2 病害癥狀描述

根據(jù)西瓜炭疽病田間危害的癥狀特點(diǎn)進(jìn)行描述記載。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 病原菌形態(tài)特征觀察

將純化菌株接種于PSA平板，25 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌落顏色、形狀、菌絲疏密程度。產(chǎn)孢后觀察孢子形態(tài)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，測(cè)量孢子大小。

1.3.2 柯赫氏法則證病

選用健康的西瓜(品種‘地雷王’)離體葉片、莖蔓、果實(shí)，均用無菌水清洗，乙醇表面消毒30 s，設(shè)無傷接種、針刺接種、孢子懸浮液(無菌水配制濃度為1×104個(gè)/mL)接種3種處理，每處理重復(fù)3次。無菌水處理作對(duì)照，25 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察記錄發(fā)病情況。

1.3.3 病原菌rDNA-ITS序列分析

將菌株于PSA培養(yǎng)基、25 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)15 d后收集菌絲，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′)對(duì)病原菌的ITS和5.8S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25.0 μL：10×PCR buffer 2.5 μL；MgCl22.0 μL；dNTP 1.5 μL；Taq酶(5U/L)0.2 μL；ITS1(10 μmol/L)2.0 μL；ITS4(10 μmol/L)2.0 μL；模板DNA 2.0 μL；ddH2O 12.8 μL(擴(kuò)增所用試劑DL2 000、dNTPs、Taq酶購于TaKaRa)。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，最終4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.4 病菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.4.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

選用馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)、胡蘿卜瓊脂(CA)、水瓊脂(WA)、查氏(Czapek)、改良查氏(Modified Czapek)、燕麥片瓊脂(OMA)、玉米粉瓊脂(CMV)、番茄燕麥片(番茄200 g，燕麥片30 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL)、西瓜果肉煎汁(西瓜果肉200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL)、西瓜皮煎汁(西瓜果皮200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL)和西瓜莖葉煎汁(西瓜莖蔓100 g，西瓜葉干粉100 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL)共11種培養(yǎng)基[3]。移植菌餅直徑7 mm，25 ℃恒溫培養(yǎng)。每處理設(shè)3次重復(fù)。15 d后采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，30 d后利用Neubauer血球計(jì)數(shù)板測(cè)定產(chǎn)孢量，進(jìn)行方差分析和多重比較。

1.4.2 不同碳源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

以PSA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別將蔗糖等量替換為淀粉、乳糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖、甘露醇，共8種碳源[4]。采用1.4.1的方法測(cè)定記錄病菌菌落直徑和產(chǎn)孢量。孢子萌發(fā)測(cè)定，供試8種碳源同上，按2%的濃度配制培養(yǎng)液，孢懸液濃度為40倍鏡下60～80個(gè)孢子，分別吸取孢懸液0.5 mL與2%碳源培養(yǎng)液0.5 mL等量混合，采用凹玻片萌發(fā)法，無菌水為對(duì)照，25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)。重復(fù)3次。12 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率。

1.4.3 不同氮源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

以PSA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以0.5%的量加入丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脲、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨和硝酸鉀，共8種氮源。采用1.4.1的方法測(cè)定記錄病菌菌落直徑和產(chǎn)孢量。孢子萌發(fā)測(cè)定，供試8種氮源同上，按2%的濃度配制培養(yǎng)液，采用凹玻片萌發(fā)法，方法同1.4.2，25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)。重復(fù)3次。12 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率。

1.4.4 不同溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

采用PSA培養(yǎng)基，設(shè)置4、10、15、20、25、30、35 ℃共7個(gè)溫度梯度[5]。采用1.4.1的方法測(cè)定記錄病菌菌落直徑和產(chǎn)孢量。孢子萌發(fā)測(cè)定，溫度梯度設(shè)置同前，孢懸液配制同1.4.2，吸取懸浮液1 mL滴加于凹玻片上，采用凹玻片萌發(fā)法，重復(fù)3次。12 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率。

1.4.5 不同pH對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

采用PSA平板培養(yǎng)基，pH設(shè)置3、4、5、6、7、8、9、10、11共計(jì)9個(gè)梯度(用0.1%的NaOH和HCl溶液調(diào)配)[6]。采用1.4.1的方法測(cè)定記錄病菌菌落直徑和產(chǎn)孢量。孢子萌發(fā)測(cè)定，方法同前，配置9個(gè)pH梯度(同上)水溶液。采用凹玻片萌發(fā)法，方法同1.4.4，重復(fù)3次。12 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率。

1.4.6 不同光照對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

設(shè)置光照、黑暗、光暗交替共3種處理[7-9]，采用1.4.1的方法測(cè)定記錄病菌菌落直徑和產(chǎn)孢量。孢子萌發(fā)測(cè)定，方法同1.4.4，重復(fù)3次。12 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率。

1.4.7 菌絲致死溫度測(cè)定

將直徑7 mm的菌餅置于裝有無菌水的試管中，每管10塊；試管分別置于48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60 ℃的恒溫水浴鍋中，處理10 min(預(yù)熱1 min左右)，迅速冷卻后移植于PSA平板培養(yǎng)基，每皿3塊，25 ℃恒溫培養(yǎng)。每處理3次重復(fù)。7 d后觀察菌絲生長(zhǎng)狀況，確定菌絲致死溫度。

1.4.8 分生孢子致死溫度測(cè)定

取5 mL無菌水配制的孢懸液裝入試管中，將試管分別置于45～60 ℃(梯度為1 ℃)恒溫水浴鍋中處理10 min(預(yù)熱1 min左右)，采用凹載片萌發(fā)法進(jìn)行孢子萌發(fā)測(cè)定，25 ℃條件下保濕培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)。12 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀描述

西瓜炭疽菌可危害西瓜葉片、莖蔓和果實(shí)。葉片染病，形成圓形、橢圓形或不規(guī)則的病斑，邊緣褐色至黑褐色，中部顏色較淺，潮濕時(shí)葉正面輪生橘黃色黏質(zhì)小點(diǎn)，后變黑色。莖蔓受害，病斑為長(zhǎng)條形或梭形斑，邊緣褐色至黑褐色，中部顏色較淺，病斑明顯凹陷，潮濕時(shí)輪生橘黃色黏質(zhì)小點(diǎn)，后變黑色。病斑環(huán)繞莖時(shí)，導(dǎo)致病部以上植株枯死。果實(shí)發(fā)病，病斑多為圓形，擴(kuò)大后凹陷明顯。在氣溫升高的情況下，病斑部分泌出橘紅色的黏性物質(zhì)，最后導(dǎo)致果實(shí)腐爛(圖1)。

圖1 西瓜炭疽病田間發(fā)病癥狀

2.2 病原菌鑒定結(jié)果

2.2.1 病原菌形態(tài)特征

人工培養(yǎng)7 d后，菌落邊緣整齊，呈墨綠色至深灰色，氣生菌絲發(fā)達(dá)。病菌分生孢子單胞，無色，長(zhǎng)橢圓形或卵圓形，短柱狀，兩端鈍圓，大小為(14～20)μm×(5.0～6.0)μm，具1～2個(gè)油球，聚集成堆后呈粉紅色黏狀物。分生孢子梗無色，單胞，圓筒形，大小為(20～25)μm×(2.5～3.0)μm。分生孢子盤聚生，初為埋生，紅褐色，后突破表皮呈黑褐色，剛毛散生于分生孢子盤中，暗褐色，頂端色淡、略尖，基部膨大，長(zhǎng)90～120 μm，具2～3個(gè)橫隔。根據(jù)形態(tài)特征的觀察結(jié)果，初步鑒定病原菌為瓜類炭疽菌[Colletotrichumorbiculare(Berk.etMont.) Arx]。

圖2 西瓜炭疽病菌形態(tài)

2.2.2 柯赫氏法則證病結(jié)果

采用無傷接種、針刺接種和孢子懸浮液3種方法接種處理健康西瓜葉片、莖蔓和果實(shí)均見發(fā)病，對(duì)照處理未發(fā)病。接種3 d后癥狀顯現(xiàn)，針刺接種較其他2種方式發(fā)病顯癥快。7 d后觀察發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀相同，再次分離，從接種病斑中重新獲得了與原接種菌株相同的病原菌，經(jīng)鑒定為瓜類炭疽菌(C.orbiculare)。

2.2.3 病原菌rDNA-ITS序列分析測(cè)定

利用真菌通用引物ITS1/ITS4對(duì)菌株rDNA-ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出1條567 bp大小的片段。將測(cè)序獲得的序列上傳到NCBI進(jìn)行BLAST分析，菌株的rDNA-ITS序列與GenBank中收錄的瓜類炭疽菌(C.orbiculare)序列(GenBank登錄號(hào)：HM989875.1)相似性達(dá)到99%。結(jié)合形態(tài)鑒定結(jié)果，最終確定該病原菌為無性態(tài)真菌瓜類炭疽菌(C.orbiculare)。

2.3 病菌生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 培養(yǎng)基對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

西瓜炭疽菌在供試的11種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況差異較顯著。在PSA、西瓜果肉煎汁和西瓜莖葉煎汁培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)速度均較快，優(yōu)于其他培養(yǎng)基；在查氏和水瓊脂培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)較慢，菌落稀疏，最不適宜生長(zhǎng)；從產(chǎn)孢量看，西瓜莖葉煎汁、番茄燕麥片、玉米粉瓊脂、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基表面均產(chǎn)生橘紅色分生孢子團(tuán)，孢子團(tuán)數(shù)量依次遞減，其余7種培養(yǎng)基表面均不產(chǎn)生。鏡檢測(cè)知，病菌在西瓜莖葉煎汁培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，為7.15×109個(gè)/mL，后期菌落表面生出小黑點(diǎn)，鏡檢為分生孢子盤，其他培養(yǎng)基均無分生孢子盤產(chǎn)生。番茄燕麥培養(yǎng)基產(chǎn)孢量為2.23×107個(gè)/mL，燕麥片瓊脂為7.67×106個(gè)/mL，玉米粉瓊脂為2.13×107個(gè)/mL。其余7種培養(yǎng)基均不高于7×104個(gè)/mL。而水瓊脂和改良查氏培養(yǎng)基均不產(chǎn)孢(圖4)。

圖3 病原菌的ITS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖4 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

2.3.2 碳源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

病菌對(duì)8種供試碳源利用情況存在差異(圖5)。菌絲在蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好；在可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差。從產(chǎn)孢量看，產(chǎn)孢的最佳碳源為蔗糖，而在葡萄糖、麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量較少，其中在果糖、半乳糖為碳源的培養(yǎng)基上均不產(chǎn)孢。分生孢子在蔗糖溶液中，萌發(fā)率最高，為77.91%，其次為可溶性淀粉；除蔗糖和可溶性淀粉，其他6種碳源的萌發(fā)率均低于無菌水對(duì)照，可見其余6種碳源抑制孢子萌發(fā)(圖6)。

圖5 碳源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

圖6 碳源對(duì)病菌孢子萌發(fā)的影響

2.3.3 氮源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

在供試8種氮源中，病菌菌絲生長(zhǎng)差異顯著。在以NH4Cl為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最佳，其次為谷氨酸和KNO3；而以脲為氮源的培養(yǎng)基上菌絲不生長(zhǎng)。在以(NH4)2SO4為氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大；在脲和蛋白胨培養(yǎng)基上均不產(chǎn)孢(圖7)；分生孢子對(duì)于8種氮源的利用情況存在差異，在谷氨酸和KNO3溶液中，孢子的萌發(fā)率最高，分別為53.47%和52.08%，8種溶液均低于無菌水對(duì)照，說明8種氮源均抑制孢子萌發(fā)(圖8)。

圖7 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

圖8 氮源對(duì)病菌孢子萌發(fā)的影響

2.3.4 溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

測(cè)定結(jié)果表明(圖9)，病菌菌絲生長(zhǎng)溫度范圍較廣，在4～30 ℃時(shí)均可生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度差異顯著。在25 ℃時(shí)生長(zhǎng)最快，其次為20 ℃，溫度低于10 ℃或高于30 ℃時(shí)生長(zhǎng)緩慢。病菌在10～30 ℃間均可產(chǎn)孢，最適溫度為25 ℃，達(dá)75%，4 ℃和35 ℃時(shí)不產(chǎn)孢。分生孢子萌發(fā)對(duì)溫度的要求范圍較廣，在4～35 ℃時(shí)孢子均能萌發(fā)。孢子萌發(fā)的最適溫度為25 ℃，溫度升高或降低均抑制分生孢子萌發(fā)(圖10)。

圖9 溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

圖10 溫度對(duì)病菌孢子萌發(fā)的影響

2.3.5 pH對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

病菌菌絲生長(zhǎng)pH范圍廣泛，在pH 3～11間均能生長(zhǎng)，最適為6。病菌產(chǎn)孢的最適pH為6，pH為3和11時(shí)不能產(chǎn)孢(圖11)。分生孢子在pH 3～11之間均可萌發(fā)，pH 7時(shí)萌發(fā)率最高，為81.33%(圖12)。

圖11 pH對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

圖12 pH對(duì)病菌孢子萌發(fā)的影響

2.3.6 光照對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

測(cè)定結(jié)果表明，不同光照條件下菌絲生長(zhǎng)差異不顯著，在黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)略優(yōu)于光暗交替和光照條件。黑暗條件下產(chǎn)孢量稍大。黑暗條件下分生孢子萌發(fā)率最高，為73.33%，光暗交替最差，為32%，可能光照條件不穩(wěn)定不利于分生孢子萌發(fā)。

2.3.7 菌絲和分生孢子致死溫度測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果表明，在溫度≥55 ℃時(shí)，未見菌絲生長(zhǎng)，確定菌絲致死溫度為55 ℃、10 min。當(dāng)溫度≥57 ℃時(shí)，分生孢子均不萌發(fā)，確定病菌分生孢子致死溫度為52 ℃，10 min。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，該菌在人工培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)速度較為緩慢，并且在多種培養(yǎng)條件下分生孢子產(chǎn)生數(shù)量較少甚至難以產(chǎn)生。但已有報(bào)道C.orbiculare在PDA等傳統(tǒng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d即可大量產(chǎn)孢[10]，在pH7.0～12.0時(shí)，只需48 h即可產(chǎn)生分生孢子[11]，但作者應(yīng)用此方法在30 d后仍未獲得大量孢子。有報(bào)道指出，在Colletotrichum屬真菌中，部分種較難產(chǎn)生大量分生孢子甚至難以產(chǎn)孢，例如山藥炭疽病菌(C.gloeosprioides)僅在改良查氏培養(yǎng)基上才能產(chǎn)生分生孢子，在其他培養(yǎng)基上均不產(chǎn)孢。田七炭疽病菌(C.gloeosprioides)在PDA培養(yǎng)基上有產(chǎn)孢型與不產(chǎn)孢型之分，但采用“植物組織+PDA”培養(yǎng)不產(chǎn)孢型，可誘發(fā)產(chǎn)孢成功。采用田七組織+PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，則使不產(chǎn)孢型在田七組織上形成具有剛毛的分生孢子盤和分生孢子。同時(shí)用其他植物組織培養(yǎng)不產(chǎn)孢型，也可形成分生孢子盤和分生孢子，其中番茄、龍葵、煙草等茄科植物組織上的產(chǎn)孢量較大[12]。芒果炭疽病菌(C.gloeosprioides)在普通的真菌培養(yǎng)基(如PDA等)上產(chǎn)孢量極低，難以滿足試驗(yàn)上對(duì)分生孢子量的需求，只在含酵母膏的培養(yǎng)基上大量產(chǎn)孢[13]。這些研究表明，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分是炭疽菌是否產(chǎn)孢的重要因素。

本研究首次采用西瓜莖葉煎汁培養(yǎng)基作為C.orbiculare的產(chǎn)孢培養(yǎng)基獲得成功。經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證結(jié)果表明，西瓜莖葉煎汁培養(yǎng)基、25 ℃恒溫黑暗條件、培養(yǎng)30 d，能促使瓜類炭疽菌產(chǎn)生大量的分生孢子，高達(dá)7.15×109個(gè)/mL，是PSA等傳統(tǒng)培養(yǎng)基產(chǎn)孢量的104倍左右，保證了后續(xù)試驗(yàn)的正常進(jìn)行。并且培養(yǎng)15 d時(shí)，在PSA等傳統(tǒng)培養(yǎng)未產(chǎn)孢時(shí)，在西瓜莖葉煎汁培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量已達(dá)到2.85×107個(gè)/mL，產(chǎn)孢時(shí)間縮短了1/2。由此也佐證了寄主天然物質(zhì)對(duì)病菌分生孢子的產(chǎn)生具有明顯的促進(jìn)作用。這表明該菌在產(chǎn)孢時(shí)需要消耗某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而天然物質(zhì)培養(yǎng)基中恰好滿足，至于何種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)該菌分生孢子的形成最佳尚待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，病菌菌絲生長(zhǎng)的最適條件為PSA培養(yǎng)基、25 ℃、pH6.0、黑暗；分生孢子產(chǎn)生最適條件為西瓜莖葉煎汁培養(yǎng)基、蔗糖、(NH4)2SO4、25 ℃、pH6.0、黑暗；病菌菌絲致死溫度為55 ℃、10 min；分生孢子致死溫度為52 ℃、10 min。

試驗(yàn)結(jié)果分析認(rèn)為，不同的營(yíng)養(yǎng)成分、溫度、pH等條件對(duì)西瓜炭疽病菌的菌絲生長(zhǎng)和分生孢子產(chǎn)生有顯著影響。病菌菌絲在光照、光暗交替、黑暗3種條件下均可正常生長(zhǎng)且差異不顯著，說明光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)和分生孢子的產(chǎn)生無顯著影響；弱酸性適宜菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢；25 ℃最適合菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢。這些特性與該病每年8月高溫季節(jié)田間易于發(fā)生流行基本吻合。從對(duì)C.orbiculare生物學(xué)特性室內(nèi)測(cè)定結(jié)果可推知，田間溫度對(duì)西瓜炭疽病流行的影響，與病菌旺盛生長(zhǎng)導(dǎo)致田間西瓜嚴(yán)重發(fā)病關(guān)系密切。高溫且連續(xù)陰雨的氣候條件利于炭疽病流行蔓延。因此，在高溫多雨的病害盛發(fā)初期，生產(chǎn)上應(yīng)加強(qiáng)對(duì)病害的預(yù)防工作。試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，病菌在田間發(fā)病適宜條件較為廣泛，病情較難控制。但病菌在偏低溫度下生長(zhǎng)緩慢，菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢較喜弱酸性，據(jù)此,在生產(chǎn)中可適當(dāng)調(diào)節(jié)溫度，提高土壤堿性，以此達(dá)到抑制菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的目的。減少病菌的殘留和生存的機(jī)會(huì)，以減緩病害。

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IdentificationandbiologicalcharacteristicsofwatermelonanthracnosecausedbyColletotrichumorbiculareinLiaoningProvince

Tang Shuangshuang1, Liu Zhiheng1, Yu Zhaoge1, Zheng Chuan1, An Xin1, Li Jianbing1, Zhao Tingchang2

(1.CollegeofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity，Shenyang110866，China；2.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

The watermelon anthracnose pathogens and their biological characteristics were studied. By morphological identification, card of Koch’s postulation, rDNA-ITS sequencing, the watermelon anthracnose pathogenColletotrichumorbicularewas identified. Biological characteristics measurement showed that PSA was the optimal medium for hyphal growth. The optimum carbon and nitrogen sources were sucrose and NH4Cl; the optimal temperature was 25 ℃;the optimal pH value was 6. The dark condition was conducive to bacterial growth. Fried juice of watermelon stems and leaves was the optimal culture medium for bacterial spores, and the optimum carbon, and nitrogen sources were sucrose and (NH4)2SO4; the optimal temperature was 25 ℃ and the optimal pH value was 6; dark condition was conducive to spores. Mycelial lethal temperature was 55 ℃ for 10 min, and conidial lethal temperature was 52 ℃ for 10 min.

watermelon anthracnose;Colletotrichumorbiculare; identification； rDNA-ITS； biological characteristics

2013-09-19

：2013-12-28

國(guó)家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-26)

S 436.5

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.04.007

* 通信作者 E-mail: lzhh1954@163.com