付鑫鑫，田志華，郝鋼華，劉占穩(wěn)，劉金，邢軍

論著·基礎(chǔ)

辛二酰苯胺異羥肟酸對(duì)裸鼠人宮頸癌移植瘤的作用及其機(jī)制

付鑫鑫，田志華，郝鋼華，劉占穩(wěn)，劉金，邢軍

目的觀察辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)對(duì)裸鼠人宮頸癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用,并對(duì)藥物作用機(jī)制進(jìn)行探討。方法培養(yǎng)人宮頸癌SiHa細(xì)胞接種至20只裸鼠右下肢背側(cè)根部皮下,15 d后將成瘤的18只裸鼠隨機(jī)分3組：空白對(duì)照組、SAHA1組(25 mg/kg)、SAHA2組(50 mg/kg)，每組6只。連續(xù)4 d腹腔注射藥物，間歇7 d，再連續(xù)給藥4 d，1次/d。觀察各組裸鼠宮頸癌移植瘤的生長(zhǎng)情況，計(jì)算抑瘤率。免疫組化分析及Western blot方法檢測(cè)各組移植瘤中的Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果空白對(duì)照組抑廇率為0，SAHA1組為22.44%， SAHA2組為35.52%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。用藥后，SAHA2組裸鼠體質(zhì)量低于空白對(duì)照組及SAHA1組(P<0.05)。SAHA1組與SAHA2組腫瘤體積均小于空白對(duì)照組，且SAHA2組小于SAHA1組(P均<0.05)。與空白對(duì)照組相比，SAHA1組與SAHA2組裸鼠腫瘤質(zhì)量低，且SAHA2組低于SAHA1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；免疫組化及蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，SAHA1組、SAHA2組Bax蛋白均明顯升高，Bcl-2 蛋白均明顯降低(P均<0.05)。而SAHA2組較SAHA1組變化更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論SAHA可以有效抑制人宮頸癌SiHa細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，Bax/Bcl-2相關(guān)的細(xì)胞凋亡是其抑癌機(jī)制之一。

辛二酰苯胺異羥肟酸；宮頸癌 ；裸鼠；Bcl-2；Bax

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，其發(fā)生率及病死率居女性腫瘤前位。傳統(tǒng)的抗癌手段——化療，因其對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用而限制了其抑癌效果。組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACI)是一類以基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)遺傳調(diào)節(jié)為原理的新型抗癌試劑，作為一種新型癌癥治療藥物蓄勢(shì)待發(fā)。HDACI主要是通過改變組蛋白的乙酰化水平調(diào)整染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，調(diào)控基因的表達(dá)以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡等機(jī)制抑制癌癥。辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)已用于臨床治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，其對(duì)宮頸癌的作用也有相關(guān)的研究[1，2]，有研究報(bào)道，SAHA可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)[3]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本文通過SAHA作用于宮頸癌SiHa細(xì)胞系裸鼠移植瘤觀察SAHA對(duì)宮頸癌的影響，研究其可能抗癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸鱗癌細(xì)胞株SiHa貼壁細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。SPF級(jí)雌性(BALB/c)裸鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司。試劑：SAHA(美國(guó)Cayman公司),順鉑(云南個(gè)舊生物藥業(yè)有限公司)，Bax兔源單克隆抗體、Bcl-2兔源單克隆抗體、一抗及二抗抗體稀釋液(北京博奧森生物有限公司)，SP試劑盒(北京四正柏試劑公司)，羊抗兔多克隆抗體(美國(guó)Earthox生物試劑公司)，β-actin(美國(guó)Santa cruz公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(杭州碧云天生物試劑公司)，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(北京拜爾迪生物技術(shù)公司)，DAB顯色劑(北京中杉試劑公司)等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將宮頸鱗癌細(xì)胞株SiHa貼壁細(xì)胞置入含100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液,于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2～3 d換1次新鮮培養(yǎng)基。0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化,收集并傳代。選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 異種移植裸鼠模型 配制3.2 ×107/ml SiHa宮頸癌腫瘤單細(xì)胞懸液，選擇4～5周齡的雌性無胸腺裸鼠20只，皮下注射于裸鼠的近右側(cè)下肢背側(cè)根部。裸鼠于接種后的第15天成瘤，根據(jù)設(shè)定的入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)移植瘤腫瘤直徑約8 mm；(2)裸鼠精神、飲食、活動(dòng)等一般情況良好；(3)接種處局部無感染征象，無其他器質(zhì)性疾病，瘤體無缺血壞死征。去除2只成瘤未成功的裸鼠，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、SAHA 1組、SAHA 2組，每組6只，成瘤后開始腹腔注射用藥?？瞻讓?duì)照組：生理鹽水0.2 ml；SAHA1組：SAHA (25 mg/kg)0.2 ml;SAHA2組：SAHA(50 mg/kg)0.2 ml ；第1、2、3、4天每日接受注射1次，停藥7 d后再連續(xù)注射4 d，每日1次，共注射8次。SAHA粉劑250 mg用二甲基亞砜(DMSO)稀釋成50 mg/ml的儲(chǔ)存液充分溶解，使用時(shí)用生理鹽水稀釋配制不同濃度的工作液。

1.4 觀測(cè)項(xiàng)目 每天觀察評(píng)估裸鼠一般情況，包括裸鼠毛色、食欲及精神狀態(tài)、體質(zhì)量等。用藥后第16天處死裸鼠，收集腫瘤組織，測(cè)量腫瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。將瘤體組織分成2份，一份置于 10%福爾馬林中固定，然后石蠟包埋備用；一份液氮迅速冰凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)：采用鏈霉卵白素—生物素過氧化物酶法(SP法)檢測(cè)移植瘤組織Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)。石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。根據(jù)免疫組化試劑盒說明書對(duì)切片進(jìn)行染色，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果分析采用計(jì)數(shù)法，每張切片任意選取400倍光鏡下6個(gè)完整視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。結(jié)果判定：以染色分?jǐn)?shù)評(píng)分(染色強(qiáng)度)評(píng)定：腫瘤細(xì)胞染成深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性3分，棕黃色為陽(yáng)性2分，淺黃色為弱陽(yáng)性1分，無著色為陰性0分。陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分：腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率>70%～100%為3分，30%～70%為2分，10%～>30%為1分，<10%為0分。以染色分?jǐn)?shù)評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分即為染色指數(shù)。染色指數(shù)≥3分為陽(yáng)性；<3為陰性[4]。

1.4.2 Western blot 分析：儲(chǔ)存于-80 ℃的移植瘤組織樣品于分析前在冰上解凍匯集，加入RIPA緩沖液和蛋白酶抑制劑，在冰上勻漿、澄清并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的BCA蛋白測(cè)定分析后儲(chǔ)存于-80 ℃下備用。從每組樣品中取20 μg蛋白質(zhì)，上樣到預(yù)制的SDS-聚丙烯酰胺凝膠泳道，轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜。加一抗封閉膜，4℃ 孵育過夜， 洗膜后在室溫下孵育于羊抗兔的二抗稀釋液中1 h，洗膜30 min，用BCIP/NBT避光顯色。β-actin做內(nèi)參對(duì)照，結(jié)果掃描后以Image 分析軟件計(jì)算出灰度值，分析蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 裸鼠移植瘤模型建立 接種15 d后18只裸鼠成瘤，腫瘤移植成瘤率為90%。用藥期間觀察各組裸鼠一般情況好，皮膚紅潤(rùn)，進(jìn)食飲水無明顯變化。

2.2 抑瘤率比較 于用藥結(jié)束后的第1天拉頸處死，稱重瘤組織，計(jì)算抑瘤率=(空白對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/空白對(duì)照組瘤重×100%，各組的抑廇率分別為空白對(duì)照組0、SAHA1組22.44%、SAHA2組35.52%，各組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表1 3組裸鼠用藥前后體質(zhì)量、腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量比較

注：與用藥前比較，*P<0.05；與空白對(duì)照組比較，#P<0.05；與SAHA1組比較，△P<0.05

2.3 體質(zhì)量及腫瘤體積變化 用藥前各組裸鼠體質(zhì)量與腫瘤體積進(jìn)行檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。用藥結(jié)束后，空白對(duì)照組及SAHA1組體質(zhì)量較用藥前均明顯增加(P均﹤0.05)，而SAHA2組裸鼠體質(zhì)量較用藥前無明顯化(P>0.05)，且用藥結(jié)束后，SAHA2組裸鼠體質(zhì)量低于其他2組(P均<0.05)，用藥前后測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)，計(jì)算體積。用藥結(jié)束后3組腫瘤體積較用藥前增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且用藥后，與空白對(duì)照組相比，SAHA1組及SAHA2組腫瘤體積均縮小，且SAHA2組較SAHA1組腫瘤體積明顯縮小(P<0.05)。見表1。

2.4 免疫組化檢測(cè)移植瘤中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要位于胞質(zhì)，陽(yáng)性染色呈棕黃色，散在分布(圖1見封3)。與空白對(duì)照組比較，SAHA1組、SAHA2組Bax表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而SAHA2組較SAHA1組升高更明顯(P<0.05)。Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要位于胞漿，陽(yáng)性染色呈棕黃色，呈散在分布(圖2見封3)。與空白對(duì)照組比較，SAHA1組、SAHA2組Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著降低(P<0.05)。而SAHA2組較SAHA1組降低更明顯(P<0.05)。見表2。

表2 各組移植瘤中Bax、Bcl-2染色指數(shù)比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與SAHA1組比較，#P<0.05

2.5 蛋白印跡法檢測(cè)移植瘤中Bax、Bcl-2蛋白比較 在預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)約21kDa見Bax特異性蛋白條帶，26kDa處見Bcl-2特異性蛋白條帶(見圖3)。各組移植瘤組織中Bax及Bcl-2蛋白的檢出率均為100%，與空白對(duì)照組比較，SAHA1組、SAHA2組Bax蛋白表達(dá)水平升高、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P均﹤0.05)，且SAHA2組較SAHA1組改變更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組移植瘤中Bax、Bcl-2蛋白灰度值的表達(dá)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與SAHA1組比較，#P<0.05

圖3 Western blot檢測(cè)各組移植瘤中Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)

3 討 論

宮頸癌作為常見的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量，甚至威脅女性生命。宮頸癌治療中化療是作為輔助手術(shù)或放療的主要手段，改善了無數(shù)腫瘤患者的預(yù)后，提高了生存期。但由于放療對(duì)正常器官組織細(xì)胞的副損傷，化學(xué)藥物常因缺乏靶標(biāo)的選擇性產(chǎn)生較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)、嚴(yán)重的耐藥性等極大地限制了放療照射及化學(xué)藥物的應(yīng)用劑量，限制了其作用效果，影響了臨床療效。

近年來，腫瘤治療的研究方向主要傾向于研發(fā)新的藥物，既可以改善目前化療藥物的缺陷，并且能保持強(qiáng)有力的抗癌活性。HDACI已經(jīng)被證實(shí)具有廣泛的抗腫瘤作用，對(duì)多種來源的腫瘤細(xì)胞，包括膀胱、骨、乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、食管、肺、卵巢、胰腺、前列腺等均表現(xiàn)出良好的殺傷效果[5]。HDACI通過抑制HDAC，糾正腫瘤細(xì)胞的異常乙?；癄顟B(tài)，復(fù)活沉默的基因抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展?，F(xiàn)已知的HDACI作用于腫瘤細(xì)胞的機(jī)制主要是：誘導(dǎo)細(xì)胞分化，阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]，影響免疫和血管生成等。目前，有關(guān)HDACI對(duì)宮頸癌的抗腫瘤機(jī)制的研究較多，對(duì)其細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及細(xì)胞凋亡等機(jī)制的研究也有了一定基礎(chǔ)。本結(jié)果顯示，低劑量的SAHA1組抑廇率為22.44%，高劑量的SAHA2組抑廇率為35.52%，用藥結(jié)束后，SAHA1、SAHA2組體積均小于空白對(duì)照組，腫瘤質(zhì)量也低于空白對(duì)照組，提示SAHA在體內(nèi)可有效抑制SiHa宮頸癌移植瘤的生長(zhǎng)。而且，高劑量的SAHA比低劑量SAHA作用顯著。另外，在用藥期間，各用藥組裸鼠均無明顯不適，精神、活動(dòng)、飲食、二便等一般情況與空白對(duì)照組無明顯差異，用藥結(jié)束后裸鼠體質(zhì)量與用藥前相比無明顯下降，這可能提示SAHA對(duì)患有宮頸癌的裸鼠無明顯不良反應(yīng)。以往也有研究發(fā)現(xiàn)SAHA在裸鼠體內(nèi)對(duì)T淋巴細(xì)胞瘤、乳腺癌有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，且無明顯不良反應(yīng)[7，8]。

應(yīng)用SAHA后裸鼠腫瘤組織Bax蛋白表達(dá)增加及Bcl-2蛋白表達(dá)減少。Bax/Bcl-2作為線粒體途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因[9]，其比值決定著細(xì)胞受刺激后凋亡或存活。Bax/Bcl-2相關(guān)的凋亡途徑是化療藥物、細(xì)胞毒性物質(zhì)對(duì)外界應(yīng)激條件下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要途徑，即線粒體途徑。死亡信號(hào)激活Bax后，Bax從細(xì)胞漿移位到線粒體膜上，可通過自身形成同源二聚體，或通過與Bcl-2形成異源二聚體以失活Bcl-2抑制其作用，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。當(dāng)Bcl-2相對(duì)較多時(shí)，Bcl-2和Bax的異源二聚體增多，消除Bax的促凋亡作用，因而其抑制細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)，凋亡趨勢(shì)減弱[10]；而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白表達(dá)相對(duì)較多時(shí)，則Bax本身形成的同源二聚體占主導(dǎo)，則促凋亡作用增強(qiáng)[11]。簡(jiǎn)單來說，就是Bax 優(yōu)勢(shì)時(shí)細(xì)胞凋亡，Bcl-2 優(yōu)勢(shì)時(shí)細(xì)胞存活。Meng等[12]用 Trichostatin A(TSA)作用于2種結(jié)直腸癌HT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TSA可誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，降低抗凋亡蛋白Bcl-2 和Bcl-xL的表達(dá)，經(jīng)減少線粒體膜電位和Caspase-3激活的線粒體途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡；Wang等[13]在應(yīng)用過Sirtinol的人乳腺癌MCF 7細(xì)胞中觀察到促進(jìn)細(xì)胞凋亡，即上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2以及細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)；Jeon等[14]發(fā)現(xiàn)MHY218,一種新的HDACI，可通過釋放的細(xì)胞色素C增加Bax/Bcl-2 比例，激活Caspase-3引起的凋亡途徑抑制人類卵巢癌細(xì)胞；Srivastava等[15]在移植了MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用了MS-275的裸鼠腫瘤細(xì)胞中Bcl-2下降以及Bax增加。因而，可認(rèn)為SAHA的抗癌作用與Bax/Bcl-2相關(guān)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，關(guān)于SAHA對(duì)宮頸癌腫瘤的促凋亡作用尚未見報(bào)道。

綜上所述，SAHA可抑制人宮頸癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制與細(xì)胞凋亡有關(guān)，通過促進(jìn)與Bax/Bcl-2相關(guān)的細(xì)胞凋亡途徑，增加位于線粒體外膜的Bax蛋白的表達(dá)水平，下調(diào)釋放到細(xì)胞質(zhì)的Bcl-2蛋白水平，降低Bcl-2/Bax的比例，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。SAHA不良反應(yīng)小，是一種相對(duì)安全有效的藥物，可作為臨床治療宮頸癌的抗癌藥繼續(xù)研究。

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InhibitioneffectsofSAHAonhumancervicalcancercellsinnudemicexenografts

FUXinxin*,TIANZhihua,HAOGanghua,LIUZhanwen,LIUJin,XINGJun.

*DepartmentofObstetricsandGynecology,HebeiUnitedUniversityAffiliatedHospital,Tangshan063000,ChinaCorrespondingauthor:XINGJun,E-mail:mdxj2012@163.com

ObjectiveTo observe the tumor growth inhibition effect of SAHA to human cervical cancer transplanted in nude mice and to discusSthe mechanism.MethodsCultured human cancer cell lineSin nude mice inoculated to 20 dorsal rootSof the right lower limb subcutaneous,15 d after the tumor will become 18 mice were randomly divided into three groupSwith each included 6 mice:blank control group,SAHA1 group (25 mg/kg),SAHA2 group (50 mg/kg). Consecutive 4d intraperitoneal injection of drugs,intermittent 7 d,and then continuously administered 4 d,1 times/d. Observe the growth of cancer xenograftSin nude mice in each group,the inhibition rate waScalculated. Immunohistochemistry and Western blot analysiSwaSused to detect the expression of tumor in each group Bax and Bcl-2 protein.ResultsTumor suppression in blank control group waS0,SAHA1 group waS22.44%,SAHA2 group waS35.52% ,the two groupSwaSstatistically significant difference (P<0.05). After treatment,SAHA2 group nude body masSwere lower than the blank control group and SAHA1 group (P<0.05). After treatment,SAHA1 group SAHA2 tumor volume waSlesSthan the blank control group,and the SAHA2 group waSlesSthan SAHA1 group(P<0.05). Compared with the blank control group,SAHA1 group and SAHA2 nude mice'StumorSwith low quality,and SAHA2 group lower than SAHA1 group,the differenceSwere statistically significant (P<0.05);in immunohistochemistry test and protein blotting method,compared with blank control group,tumor tissue Bax protein in SAHA1 group and SAHA2 group were significantly increased,Bcl-2 protein were significantly lowered (P<0.05). the changeSin SAHA2 group were more obviouSthan SAHA1 group (P<0.05).ConclusionSAHA can inhibit human cancer xenograft SiHa cell growth,Bax/Bcl-2 -related apoptosiSiSone of the tumor suppressor mechanism.

Suberoylanilide hydroxamic acid; Cervical cancer; Nude mice; Bcl-2; Bax

063000 唐山，河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(付鑫鑫、劉金、邢軍); 062552 任丘市華北石油總醫(yī)院二部 醫(yī)院婦產(chǎn)科(田志華、郝鋼華)；任丘市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科(劉占穩(wěn))

邢軍，E-mail:mdxj2012@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.04.023

2013-11-19)