孫衛(wèi)文，詹麗璇， 曾 瑋，徐 恩

缺氧是導(dǎo)致新生兒缺氧性腦病和癇性發(fā)作的主要原因。新生兒期或圍產(chǎn)期缺氧的患兒成年后對(duì)致癇因素的敏感性升高［1］，其機(jī)制尚未明確。過(guò)度的Ca2+內(nèi)流是導(dǎo)致細(xì)胞缺氧性損傷的關(guān)鍵因素。缺氧后，興奮性神經(jīng)元被激活，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，對(duì)細(xì)胞起毒性作用，抑制性神經(jīng)元?jiǎng)t反之。小白蛋白(parvalbumin，PV)是鈣結(jié)合蛋白超家族中的一種，對(duì)Ca2+有很高的親和力，能結(jié)合細(xì)胞內(nèi)游離鈣，緩沖Ca2+，對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)鈣超載［2］和維持神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定［3］。本研究選用新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型，觀察缺氧后海馬PV的表達(dá)，并檢測(cè)海馬Ca2+熒光強(qiáng)度，初步探討PV在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

新生10 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠128只(由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，置于光照∶黑暗=12∶12標(biāo)準(zhǔn)光照周期的動(dòng)物房喂養(yǎng)，母鼠與同窩新生大鼠同籠飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作及飼養(yǎng)均符合中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。新生大鼠分為缺氧組和對(duì)照組，每組64只。

1.2 研究方法

1.2.1 制備缺氧性癇性發(fā)作模型 缺氧組采用改良的新生大鼠缺氧性癇性發(fā)作模型［4］，大鼠置于恒溫34℃的大小9000 cm2的密閉箱內(nèi)，連續(xù)通入含有5%氧氣、95%氮?dú)獾幕旌蜌怏w，對(duì)照組通入常氧(21%氧氣、89%氮?dú)獾幕旌蜌怏w)，共通氣17 min。大鼠在進(jìn)行缺氧時(shí)出現(xiàn)面部痙攣、節(jié)律點(diǎn)頭、跌倒等表現(xiàn)。根據(jù)經(jīng)典的Racine標(biāo)準(zhǔn)［2］對(duì)動(dòng)物表現(xiàn)進(jìn)行分級(jí)。出現(xiàn)全身性驚厥或大發(fā)作表現(xiàn)(即4、5級(jí))的大鼠為入組標(biāo)準(zhǔn)。本研究中缺氧組大鼠缺氧時(shí)強(qiáng)直性陣攣發(fā)作表現(xiàn)較一致，重復(fù)性好，所有大鼠評(píng)分達(dá)到4、5級(jí)。

1.2.2 腦組織取材 分別于缺氧/常氧處理后1 d、3 d、7 d和14 d 2組各取16只大鼠取腦組織。麻醉后(用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的大鼠采用脊椎牽引脫臼法處死)于冰臺(tái)上迅速分離海馬組織，液氮快速冷凍后保存于－70℃冰箱中。另外，大鼠麻醉后用4℃生理鹽水經(jīng)心臟快速灌注，隨后用4℃的4%多聚甲醛以先快后慢的速度固定，取腦經(jīng)后固定、梯度蔗糖多聚甲醛溶液脫水、冰凍切片(片厚40 μm)后，選取相鄰海馬區(qū)腦片。各組中6只大鼠腦組織用于免疫組化，4只用于Western Blot，6只用于流式細(xì)胞術(shù)。

1.2.3 Nissl染色 1%焦油紫溶液染色15 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。

1.2.4 免疫組化 腦片用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 值 7.4)洗 3 次各 5 min，3%H2O2室溫孵30 min，加入稀釋的鼠來(lái)源單克隆抗體PV(1∶8 000;Chemicon)，4℃振蕩孵育過(guò)夜。PBS洗3次，加入含生物素標(biāo)記的羊抗鼠第二抗體，室溫孵育2 h，PBS洗3次各5 min，加入含辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育30 min。PBS洗3次各5 min，DAB顯色。梯度酒精脫水，透明，封片。

1.2.5 Western Blot 組織按 1 mg∶50 μl比例加入預(yù)冷的全細(xì)胞裂解液，勻漿后裂解30 min，20 000 r/min離心30 min(4℃)后提取上清液即為細(xì)胞總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量。各組分別取等量的全細(xì)胞蛋白，用10%的 SDS聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳。100 V恒壓轉(zhuǎn)膜3 h。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TTBS漂洗10 min，3次，與一抗(PV 1∶8 000;β-actin 1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜。二抗(羊抗鼠IgG 1∶1 000)室溫反應(yīng)1 h。ECL反應(yīng)4 min后，暗室進(jìn)行X-光膠片曝光、顯影和定影。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù) 腦組織用0.25%胰蛋白酶消化30 min，以Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DuI-becco’s modified eagIe’s medium，DMEM)終止消化，過(guò)200目篩網(wǎng)，1000 r/min離心5 min。取細(xì)胞沉淀用Hanks液漂洗，離心5 min，將細(xì)胞沉淀用DMEM培養(yǎng)基制成密度為105～106細(xì)胞懸液，加入終濃度為5 μmol/L的fluo-3AM，置入37℃水浴箱中避光緩慢勻速50次/min振蕩孵育30 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清，Hanks液漂洗，如此2次。最后用含10%新生牛血清的DMEM制成密度105～106的細(xì)胞懸液。以X軸為熒光強(qiáng)度，Y軸為細(xì)胞數(shù)，以組方圖檢測(cè)樣品的平均熒光強(qiáng)度值來(lái)表示神經(jīng)元內(nèi)［Ca2+］i的相對(duì)濃度大小。計(jì)算機(jī)存檢數(shù)據(jù)，檢測(cè)條件(包括負(fù)載時(shí)間、熒光劑強(qiáng)度、溫度、電壓等)保持恒定。

1.3 數(shù)據(jù)采集

在光學(xué)顯微鏡(×200)下，選取雙側(cè)海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)各3個(gè)連續(xù)視野，用Image J軟件計(jì)數(shù)PV免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，每只大鼠共選取6張典型背側(cè)海馬腦片，計(jì)算其均數(shù)以精確實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。Western Blot X線膠片用Quantity One計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析，測(cè)定目標(biāo)帶灰度值，并以對(duì)照1 d組的灰度值為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。缺血組與對(duì)照組間的比較采用兩因素(處理因素與時(shí)間因素)方差分析。進(jìn)一步在同一處理組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的比較用單因素方差分析，兩兩之間的分析采用Bonferreoni檢驗(yàn);相同時(shí)間點(diǎn)兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

Nissl染色結(jié)果顯示，缺氧組中海馬各區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞漿內(nèi)尼氏體無(wú)明顯改變，未見細(xì)胞死亡。對(duì)照組海馬各區(qū)細(xì)胞排列緊密，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。

2.1 大鼠海馬各區(qū)域PV免疫組化結(jié)果

圖1 大鼠對(duì)照組(A～D)與缺氧組(E～H)海馬PV免疫組織化學(xué)結(jié)果圖

缺氧組和對(duì)照組海馬各區(qū)均可見棕褐色PV免疫陽(yáng)性細(xì)胞(見圖1)。PV陽(yáng)性神經(jīng)元胞體及突起清晰可見，主要分布于海馬CA1區(qū)的始層、CA3區(qū)的錐體細(xì)胞層和輻射層、齒狀回的顆粒細(xì)胞層以及門區(qū)，可見有部分神經(jīng)元的突起貫穿整個(gè)錐體細(xì)胞層。

各區(qū)域PV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)如表1～表3所示。CA1區(qū)PV免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)經(jīng)兩因素方差分析示，處理(缺氧與對(duì)照)主效應(yīng)(F=53.87，P ＜0.01)、時(shí)間主效應(yīng)(F=29.124，P ＜0.01)和兩者交互效應(yīng)(F=12.19，P ＜0.01)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CA3區(qū)，處理主效應(yīng)(F=38.50，P ＜0.01)、時(shí)間主效應(yīng)(F=19.96，P ＜0.01)和兩者交互效應(yīng)(F=5.98，P ＜0.01)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

DG 區(qū)，處理主效應(yīng)(F=56.28，P ＜0.01)、時(shí)間主效應(yīng)(F=28.06，P ＜0.01)和兩者交互效應(yīng)(F=8.05，P ＜0.01)亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

缺氧組內(nèi)，CA1區(qū)(F=5.69，P=0.02)、CA3區(qū)(F=6.28，P=0.02)、DG 區(qū)(F=3.41，P=0.04)各時(shí)間點(diǎn)PV免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，3 d和14 d均較1 d和7 d高(均P＜0.05)。對(duì)照組內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn) CA1區(qū)(F=53.87，P ＜0.01)、CA3區(qū)(F=38.50，P ＜0.01)、DG 區(qū)(F=40.50，P ＜0.01)PV 免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，3 d、7 d和14 d均較1 d高(均P＜0.05)。與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，在CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)，缺氧組PV免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)7 d、14 d均降低(均 P ＜0.05)，而缺氧1 d、3 d 與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

2.2 大鼠海馬PV蛋白的含量

如圖2和表4所示:海馬PV的含量經(jīng)兩因素方差分析示處理主效應(yīng)(F=6.31，P＜0.01)和時(shí)間主效應(yīng)(F=8.71，P ＜0.01)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.02，P ＜0.01)。

缺氧組內(nèi)，海馬各時(shí)間點(diǎn)PV含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F ＜0.01，P=0.98)。對(duì)照組內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn) PV 含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=6.31，P ＜0.01)，3 d、7 d 和 14 d均較1 d高(均P＜0.05)。與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，缺氧組3 d PV的含量增加，而7 d和14 d均降低(均 P ＜0.05)。

2.3 大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)的Ca2+熒光強(qiáng)度

海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度經(jīng)兩因素方差分析示，處理主效應(yīng)(F=10.10，P ＜0.01)和時(shí)間主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.19，P ＜0.01)，兩者交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.41，P=0.03)。缺氧組內(nèi)，海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=9.23，P ＜0.01)，3 d和7 d均較1 d降低(均 P ＜0.05)。對(duì)照組內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=2.23，P=0.1)。與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，缺氧組海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度均增加(均 P ＜0.01)(見表5)。

圖2 各組海馬PV Western Blot結(jié)果比較

表1 對(duì)照組與缺氧組大鼠海馬CA1區(qū)PV免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較()

表1 對(duì)照組與缺氧組大鼠海馬CA1區(qū)PV免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較()

與1 d比較，經(jīng)Bonferroni法檢驗(yàn)*P＜0.05;與7 d比較，經(jīng)Bonferroni法檢驗(yàn)#P＜0.05;與相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組比較，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d 14 d缺氧組對(duì)照組組別17.67 ±5.39 12.67 ±4.97 36.50 ±3.27*#31.33 ±6.38*19.17 ±3.813)32.83 ±6.94*34.00 ±3.69*#△44.00 ±3.29*

表2 對(duì)照組與缺氧組大鼠海馬CA3區(qū)PV免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較()

表2 對(duì)照組與缺氧組大鼠海馬CA3區(qū)PV免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較()

與1 d比較，經(jīng)Bonferroni法檢驗(yàn)*P＜0.05;與7 d比較，經(jīng)Bonferroni法檢驗(yàn)#P＜0.05;與相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組比較，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d 14 d缺氧組對(duì)照組組別14.83 ±5.35 13.50 ±3.78 30.00 ±6.69*#26.17 ±5.35*17.67 ±5.16△28.17 ±5.27*31.83 ±5.08*#△41.83 ±5.31*

表3 對(duì)照組與缺氧組大鼠海馬DG區(qū)PV免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較()

表3 對(duì)照組與缺氧組大鼠海馬DG區(qū)PV免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較()

1 d 3 d 7 d 14 d缺氧組對(duì)照組組別17.00 ±9.78 11.50 ±5.99 42.33 ±3.08*#17.00 ±9.78*25.33 ±3.45△37.50 ±5.75*33.83 ±3.55*#△42.83 ±5.57*

與1 d比較，經(jīng)Bonferroni法檢驗(yàn)*P＜0.05;與7 d比較，經(jīng)Bonferroni法檢驗(yàn)#P＜0.05;與相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組比較，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)△P ＜0.05

表4 缺氧組與對(duì)照組大鼠海馬PV蛋白含量的比較()

表4 缺氧組與對(duì)照組大鼠海馬PV蛋白含量的比較()

與1 d比較，經(jīng)Bonferroni法檢驗(yàn)*P＜0.05;與相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組比較，經(jīng)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)#P＜0.05

1 d 3 d 7 d 14 d缺氧組對(duì)照組組別177.98 ±40.58 100.00 ±0.00 153.24 ±12.22#133.75 ±12.45*124.67 ±31.32#175.26 ±24.26*163.43 ±26.36#211.73 ±26.43*

表5 缺氧組與對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的比較()

表5 缺氧組與對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的比較()

與1 d比較，經(jīng)Bonferroni法檢驗(yàn)*P＜0.05;與相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組比較，經(jīng)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)#P＜0.05

組別323.87 ±53.03#213.95 ±23.57 1 d 3 d 7 d 14 d缺氧組對(duì)照組362.57 ±92.78#210.17 ±74.12 192.03 ±36.93*#146.62 ±19.69 266.77 ±77.96*#163.97 ±48.89

3 討論

缺氧造成的癲癇樣發(fā)作多發(fā)生于兒童［5］。故新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型是研究腦缺氧的理想方法之一。本研究通過(guò)建立新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型，分別選擇缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作后不同的時(shí)間點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外首次觀察海馬中 PV及神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的變化。

PV對(duì) Ca2+有高度親和力，能夠緩沖細(xì)胞內(nèi)Ca2+，保護(hù)神經(jīng)元免受由于電壓依賴性鈣濃度過(guò)高而產(chǎn)生的損害，因而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后起著重要保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)缺氧后7～14 d PV陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)減少，海馬PV含量在缺氧后3 d較對(duì)照組增加，7～14 d則明顯減少。提示缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作后7～14 d在海馬各區(qū)的PV神經(jīng)元均受損。缺氧后3 d PV表達(dá)增加可能與缺氧后細(xì)胞內(nèi)Ca2+迅速增加促使PV表達(dá)增加以加強(qiáng)對(duì)Ca2+的緩沖能力有關(guān)。Fagel等［6］對(duì)生后3～10 d的小鼠給予慢性缺氧，發(fā)現(xiàn)在缺氧后1 m皮質(zhì)PV陽(yáng)性神經(jīng)元較正常減少;Wittner等［7］的研究發(fā)現(xiàn)，在顳葉癲癇患者的海馬非硬化CA1區(qū)PV在胞體的表達(dá)減少，嚴(yán)重海馬硬化的癲癇患者海馬CA1區(qū)僅有少量 PV陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。Schwaller等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，在戊四氮誘導(dǎo)癇性發(fā)作模型中，PV－/－基因型動(dòng)物癲癇發(fā)作程度要比PV+/+嚴(yán)重，推測(cè)由于PV神經(jīng)元功能或數(shù)量的減少導(dǎo)致大鼠癲癇易感性升高。結(jié)合我們前期研究結(jié)果［9］，推測(cè)PV神經(jīng)元的損傷及含量的減少是γ-氨基丁酸在缺氧導(dǎo)致新生大鼠癲癇易感性升高中起作用的機(jī)制之一。其機(jī)制可能與對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+緩沖能力減弱、神經(jīng)元興奮性增高及影響γ-氨基丁酸能中間神經(jīng)元的快速放電能力，減弱對(duì)錐體細(xì)胞的抑制性有關(guān)。

缺氧后細(xì)胞內(nèi)外離子穩(wěn)態(tài)失衡造成細(xì)胞死亡。Silver等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，在正常情況下神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度為 10－8～10－7mol/L，且各腦區(qū)間無(wú)明顯差別，然而在缺氧或血流阻斷30～60 s后，在皮質(zhì)觀察到微小的細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，而海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度可明顯增加至6×10－4～8×10－4mol/L。研究已證明，癲癇灶腦細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高達(dá)閾限以上是癲癇發(fā)生和癲癇腦損害的直接原因。本研究顯示:與各時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比，缺氧組海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度明顯增高，且缺氧后1 d海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度高于缺氧后3 d及7 d，提示缺氧后海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度迅速增加，我們推測(cè)由于PV神經(jīng)元發(fā)育尚不完全，因此缺氧后1 d海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度明顯增高，并且刺激海馬PV神經(jīng)元的表達(dá)以適應(yīng)神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度的增加，隨著PV神經(jīng)元的發(fā)育及代償性增加，其對(duì)Ca2+的緩沖能力增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度逐漸下降，但是在缺氧后7 d時(shí)，PV神經(jīng)元明顯減少，對(duì)抗Ca2+超載能力減弱，不能有效地緩沖細(xì)胞內(nèi)Ca2+導(dǎo)致缺氧后14 d時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度較缺氧后3 d升高。因此我們認(rèn)為缺氧對(duì)其所致的Ca2+超載導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增加，是引起癲癇發(fā)作的機(jī)制之一。由于實(shí)驗(yàn)條件及動(dòng)物模型的限制，本研究未能對(duì)海馬進(jìn)行分區(qū)檢測(cè)神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度。

綜上所述，我們推測(cè)新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作后PV神經(jīng)元的損傷、對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+緩沖能力減弱、影響中間神經(jīng)元的快速放電能力，減弱對(duì)錐體細(xì)胞的抑制，最終導(dǎo)致海馬神經(jīng)元興奮性增加是PV在新生大鼠缺氧誘導(dǎo)癇性發(fā)作后癲癇易感性升高中起作用的機(jī)制之一。缺氧后細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+增加可能是導(dǎo)致PV神經(jīng)元損傷的原因之一。

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