海廣范， 牛秉軒， 李品品， 郭蘭青， 崔泰震， 李生瑩

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院， 2 第三附屬醫(yī)院， 3 護理學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

肝癌又被稱為癌中之王，死亡率非常高，據(jù)統(tǒng)計，每年全球肝癌發(fā)病率位居惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，死亡率居第3位[1-2]，其中55%的病例發(fā)生在中國[3]。肝癌的治療方法有多種，如根治手術(shù)治療、放療、靶向治療等治療方法，其中，藥物治療即化療在肝癌的治療中仍占有重要地位[4]。但是目前化療藥物仍存在毒副作用大、腫瘤細胞對藥物產(chǎn)生耐藥、患者難以耐受等方面的問題，因此毒性作用小、不易耐藥的新的抗癌藥物的開發(fā)和研究成為研究的熱點。

溪黃草為唇形科(Labiatae)香茶菜屬(Isodon)植物，狹基線紋香茶菜[Isodonlophanthoides(Buch. Ham. ex D. Don) Hara var.gerardianus(Benth.) Hara] 為溪黃草的主要資源[5]。溪黃草為民間常用草藥，俗稱土黃連，具有涼血散瘀、退黃去濕、清熱解毒等功效，可用于肝炎、痢疾、膽囊炎、跌打腫痛等病癥的治療，后研究發(fā)現(xiàn)溪黃草具有拮抗細菌和病毒感染、抗腫瘤等的防治作用[6]。Nodosin是從溪黃草中提取出來的有效抗癌成分，其主要化學(xué)結(jié)構(gòu)是貝殼杉烷骨架的二萜，見圖1。

Figure 1. Chemical structure of nodosin.

研究發(fā)現(xiàn)，nodosin可有效保護受損的肝臟，對移植肝臟具有顯著的保護作用，該作用與血紅素加氧酶1表達增加關(guān)系密切[7-9]。海廣范等[10]研究發(fā)現(xiàn)，nodosin對HL60、LoVo、SGC7901和U87細胞都有一定程度的抑制作用，證實了nodosin體外拮抗腫瘤細胞增殖的作用，但該作用是怎么發(fā)揮的，具體作用機制尚不清楚。因此，我們以HepG2細胞為研究對象，探討nodosin對肝癌細胞株的生長抑制作用及其作用機制，為肝癌的治療和預(yù)防提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐，同時為研發(fā)新的抗癌藥物提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑材料

四甲基偶氮唑鹽(MTT)和新生小牛血清購自鄭州博興生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)和熒光標記素購自威佳生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液為Gibco產(chǎn)品；鼠抗人Bcl-2和Bax抗體為武漢博士德生物技術(shù)公司產(chǎn)品。Nodosin由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供，高效液相色譜法測定其純度為95.5%。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) HepG2細胞(人肝癌細胞株)由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室提供，在-196 ℃液氮中凍存，由本實驗室體外傳代培養(yǎng)。按照貼壁細胞的培養(yǎng)方法把HepG2細胞于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。2 d換液1次，3 d左右傳代。

2.2不同濃度nodosin對HepG2細胞形態(tài)學(xué)的影響 取對數(shù)生長期的HepG2細胞，將其濃度調(diào)整為5×107cells/L，以100 μL/well接種于96孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液并加入nodosin，使藥物濃度分別為1.25、2.5、5、10和20 μmol/L，每個濃度均設(shè)置6個復(fù)孔，并設(shè)置空白對照組。24 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

2.3MTT法檢測不同濃度nodosin對HepG2細胞生存率的影響 取對數(shù)生長期的HepG2細胞，按照每孔4×103個細胞的數(shù)量把細胞接種于96孔板， 24h后更換培養(yǎng)液，加入nodosin，使藥物濃度分別為1.25、2.5、5、10和20μmol/L，每個濃度均做6個平行孔，同時設(shè)6個空白對照孔，24h后傾倒培養(yǎng)液，每孔加入5g/LMTT15μL，4h后加入DMSO150μL，室溫放置30min后，用酶標儀在570nm波長條件下，測定各孔吸光度(A)，并計算其半數(shù)抑制濃度(IC50)。抑制率(%)=1-測定組A值/空白對照組A值×100%。

2.4流式細胞術(shù)檢測不同濃度nodosin對HepG2細胞凋亡率的影響 取對數(shù)生長期HepG2細胞，按照每孔2×106細胞量把細胞接種于6孔板中，24 h后更換培養(yǎng)液，加入nodosin，使每孔的藥物濃度分別為1.25、2.5、5、10和20 μmol/L，同時設(shè)置陰性對照組，24 h后收集細胞，PI染色，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。

2.5Bcl-2和Bax表達的檢測 取對數(shù)生長期HepG2細胞，按照每孔2×106細胞量把細胞接種于6孔板中，24h后更換培養(yǎng)液，加入nodosin，使每孔的藥物濃度分別為1.25、 2.5、5、 10和20μmol/L，同時設(shè)置陰性對照組，24h后收集細胞，用4 ℃、70%乙醇固定1h，加入抗體和熒光素過夜，加入Ⅱ抗孵育2h，然后收集細胞，吹散，上機檢測陽性細胞數(shù)量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用方差分析進行組間差異比較，采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理。

結(jié) 果

1 不同濃度nodosin對HepG2細胞形態(tài)學(xué)的影響

HepG2細胞正常對照組可見細胞飽滿，貼壁生長旺盛，細胞呈橢圓形或“燕麥”狀，排列規(guī)整，細胞間隙明顯。1.25 μmol/L nodosin處理細胞形態(tài)改變不明顯，2.5和5 μmol/L濃度組的細胞形態(tài)與正常對照組相比漂浮細胞增加，部分細胞變圓形，凋亡細胞明顯增加；10和20 μmol/L濃度組的細胞縮小，懸浮細胞明顯增多，培養(yǎng)液中有部分細胞碎片，除凋亡細胞外，細胞壞死現(xiàn)象明顯，20 μmol/L濃度組的細胞基本全部死亡，正常細胞少見，見圖2。

Figure 2. The effect of different concentrations of nodosin on HepG2 cell morphology under inverted microscope(×100).A:control group; B: HepG2 cells treated with 1.25 μmol/L nodosin for 24 h; C: HepG2 cells treated with 2.5 μmol/L nodosin for 24 h; D: HepG2 cells treated with 5 μmol/L nodosin for 24 h; E: HepG2 cells treated with 10 μmol/L nodosin for 24 h; F: HepG2 cells treated with 20 μmol/L nodosin for 24 h.

2 Nodosin對HepG2細胞增殖的抑制作用

與正常對照組相比，不同濃度的nodsin均顯著增加細胞生長抑制率(P<0.05)，說明不同濃度的nodosin均可抑制HepG2細胞的生長，20 μmol/L劑量組抑制作用最顯著，其作用呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，IC50值為5.03 μmol/L,見表1。

表1 不同濃度nodosin對HepG2細胞生長的抑制作用

*P<0.05vsnormal control.

3 細胞凋亡率的檢測結(jié)果

陰性對照組、1.25 μmol/L組、2.5 μmol/L組、5 μmol/L組、10 μmol/L組和 20 μmol/L組的凋亡率(%)分別為：0.83±0.00、4.26±0.17、13.55±2.06、21.80±3.94、35.14±6.00和47.93±3.68。

4 Bcl-2和Bax的表達

如圖3所示，5 μmol/L組Bcl-2陽性細胞比率明顯降低(P<0.05)，10 μmol/L組和20 μmol/L組Bcl-2陽性細胞比率降低更為顯著(P<0.01)。而1.25 μmol/L組Bax陽性細胞比率明顯增加，20 μmol/L組Bax陽性細胞比率達到最高值(P<0.01)，見圖4，并且兩者的表達均呈明顯的劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。

Figure 3. The detection of Bcl-2 positive cells by flow cytometry.Mean±SD.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs 0 μmol/L.

Figure 4. The detection of Bax positive cells by flow cytometry.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs 0 μmol/L.

討 論

香茶菜屬植物具有廣泛的抗癌活性，如肝癌、胃癌、白血病等，溪黃草作為香茶菜屬植物也具有類似的抗癌特性。該藥在我國分布廣泛，盛產(chǎn)于河南、河北等地，常用于呼吸道疾病、胃腸道疾病以及免疫代謝性疾病等多種疾病的治療[11]。已有大量的資料證明，該類植物除了具有抗菌、消炎、抗風(fēng)濕等作用外，還能明顯縮小多種實體瘤的體積，具有防病、治病等多種功效。Nodosin是溪黃草的重要抗癌活性成分，屬于二萜類化合物，在前期研究報道中nodosin具有良好的拮抗HepG2細胞生長增殖的活性，鑒此我們設(shè)計了該項實驗。

實驗結(jié)果提示不同濃度的nodosin對HepG2細胞具有明顯的抑制作用，并且該抑制作用呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，形態(tài)學(xué)結(jié)果表明20 μmol/L nodosin可使細胞基本全部死亡，其IC50值為5.03 μmol/L，表明nodosin對該細胞株具有比較強烈的增殖抑制作用。

細胞凋亡是指程序性細胞死亡[12]，在凋亡過程中細胞皺縮，形成凋亡小體，但不會釋放炎癥物質(zhì)[13]。很多植物性抗癌藥物都可以誘導(dǎo)細胞凋亡，那么nodosin是否是通過誘導(dǎo)細胞凋亡而抑制HepG2細胞的增殖？細胞凋亡包括內(nèi)源性途徑和外源性途徑，nodosin誘導(dǎo)細胞凋亡是通過哪種途徑完成的呢？鑒此，我們首先通過倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果顯示：不同濃度nodosin作用于HepG2細胞24 h后，細胞皺縮，大量細胞出現(xiàn)死亡，流式細胞術(shù)檢測表明，不同濃度的nodosin均可誘導(dǎo)HepG2細胞的凋亡，并且也呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，提示nodosin對HepG2細胞的抑制作用是通過誘導(dǎo)細胞凋亡實現(xiàn)的。同時，形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果顯示20μmol/L nodosin可使HepG2細胞大部分死亡，凋亡率為47.93%，提示nodosin在誘導(dǎo) HepG2細胞凋亡的同時也可能存在其它誘導(dǎo)細胞死亡的方式，也可能與實驗誤差關(guān)系密切。 Bcl-2和Bax蛋白是調(diào)控細胞凋亡的2種重要蛋白質(zhì)，Bcl-2發(fā)揮保護細胞，減少細胞凋亡的作用，而Bax則發(fā)揮誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，兩者在細胞內(nèi)的表達維持在平衡狀態(tài)，共同調(diào)控著細胞更新，如果這種平衡被打破，則容易誘發(fā)線粒體內(nèi)細胞色素C的釋放，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。結(jié)果顯示：隨著nodosin濃度的增加Bcl-2蛋白表達減少，而Bax表達增加，提示nodosin可能激發(fā)了內(nèi)源性細胞凋亡途徑，誘發(fā)Bcl-2和Bax的失衡，進而誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡。

Nodosin誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡是否還存在其它途徑？譬如對p53、caspase家族的影響尚未見報道，因此，nodosin誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的其它作用機制尚待進一步探討。

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