趙 雷， 馮業(yè)童， 董 超， 周余來， 劉朋飛△

(1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院麻醉科，廣東 深圳 518020； 2吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，吉林 長春 130021)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床常見腎臟疾病，該疾病發(fā)病率在普通人群中約為0.5%～1%，在住院患者中增長為2%～7%，而在ICU及術(shù)后患者中為4%～25%，在上述這些人群中，死亡率為28%～90%[1-2]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，人類的許多疾病均得到了有效控制，但是至今尚未發(fā)展出對AKI的有效治療方法，該疾病相關(guān)的死亡率也沒有得到明顯改善，其發(fā)病率甚至有逐年增高的趨勢。近年來的研究表明，氧自由基損傷及并發(fā)的一系列炎癥反應(yīng)可能與AKI有重要的聯(lián)系，因此，如何降低AKI中的氧自由基和某些炎癥介質(zhì)造成的損傷成為了現(xiàn)階段人們的研究重點(diǎn)[3-5]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中存在的一類成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能，而且在體外增殖能力強(qiáng)，性能穩(wěn)定，目前，研究人員已經(jīng)證實(shí)BMSCs在腎衰竭治療方面有著重要的作用[6-8]；維生素E是一種脂溶性維生素，在眾多種類的維生素中，維生素E是最主要的抗氧化劑之一，因?yàn)檠踝杂苫呤菍?dǎo)致腎細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一，所以，維生素E對急性腎衰竭也有一定的治療治療效果[9-10]。本課題組已經(jīng)證實(shí)BMSCs聯(lián)合維生素E對AKI具有一定的治療作用，而且治療效果優(yōu)于單一的治療模式，但是，相關(guān)治療機(jī)制尚不明確[11]。在本課題中，從炎癥蛋白抑制的角度進(jìn)一步分析治療機(jī)制，評價(jià)治療效果，從而進(jìn)一步促進(jìn)這種聯(lián)合治療模式在臨床腎臟疾病治療方面的應(yīng)用。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

清潔級Wistar大鼠，雄性，體重250～310 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。動(dòng)物許可證號為SCXK-(吉)2007-0003。

2 主要試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco；Percoll分離液購自Pharmacia；維生素E購自Sigma；Trizol RNA提取液購自Invitrogen；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa；所有引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成；大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES)、白細(xì)胞介素-10(interleukin 10，IL-10)以及巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2(macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)ELISA試劑盒均購自ASSAY；IX-70倒置相差顯微鏡及正置生物學(xué)顯微鏡均購自O(shè)lympus；EXL-808酶標(biāo)檢測儀購自美國寶特公司；PCR儀購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；real-time Quality PCR儀購自MJ Research。

3 方法

3.1大鼠BMSCs的分離培養(yǎng) 從雄性Wistar大鼠的股骨和脛骨中分離骨髓，并進(jìn)一步用1 073 g/L的Percoll分離液分離骨髓中的BMSCs，用含10 %胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。采用流式細(xì)胞術(shù)對BMSCs的特異蛋白的表達(dá)進(jìn)行鑒定，同時(shí)，利用成骨分化培養(yǎng)基和成脂分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)BMSCs定向分化，結(jié)果表明所獲得的BMSCs具有正常的間充質(zhì)細(xì)胞表型，而且具有向成骨和成脂方向分化的潛能，具體鑒定結(jié)果可參考本課題組前期文章[11]。

3.2大鼠AKI動(dòng)物模型的制備與治療 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分6組，即空白對照組、造模組、造模+陽性藥物組、造模+維生素E組、造模+BMSCs組和造模+BMSC+維生素E組，每組6只大鼠。造模時(shí)大鼠每天給予腹腔注射慶大霉素140mg/kg，連續(xù)注射6d，造模結(jié)束后第1天開始進(jìn)行治療。本研究的陽性藥物選用地塞米松，劑量為每天0.08mg/kg，維生素E劑量為每天80mg/kg，BMSCs劑量為每天每只大鼠1×106cells，均為尾靜脈注射，空白對照組和模型組給予等量溶劑，此階段各個(gè)實(shí)驗(yàn)組均連續(xù)注射6d。

3.3炎癥蛋白mRNA表達(dá)水平檢測 治療結(jié)束后第1天，處死各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，收集每組腎臟組織，各取40 mg的腎臟組織用1 mL Trizol 裂解液裂解，提取RNA后，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)，并以反轉(zhuǎn)后的cDNA為底物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的操作，具體的反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作過程及反應(yīng)程序均按試劑盒說明書進(jìn)行，引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的引物

3.4炎癥介質(zhì)的蛋白表達(dá)水平檢測 在治療結(jié)束后，收集各實(shí)驗(yàn)組大鼠血液，離心后分離血漿成分，用于炎癥蛋白的分析。同時(shí)，收集各實(shí)驗(yàn)組的腎臟組織，每組取0.2 g 腎臟組織用于組織研磨，離心后進(jìn)一步收集組織研磨液，用于檢測炎癥蛋白。通過ELISA法從蛋白水平評價(jià)各實(shí)驗(yàn)組血漿和腎臟組織中炎癥蛋白的表達(dá)量，具體的操作過程按ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析，各組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BMSCs的分離培養(yǎng)結(jié)果

采用密度梯度離心法分離的大鼠BMSCs，用含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，可以見到分離培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞呈長梭形貼壁生長(圖1A)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，可以見到細(xì)胞的生長密度逐漸增大(圖1B)，一般4～6 d后，即可見到細(xì)胞的密集生長狀態(tài)(圖1C)。由此可見，本研究分離的大鼠BMSCs具有一定的體外增殖能力。

2 炎癥蛋白基因在腎臟組織中的表達(dá)結(jié)果

單一的維生素E不能顯著改變MCP-1和IL-10的表達(dá)，但是對于RANTES以及MIP-2的表達(dá)具有一定的抑制作用；另外，經(jīng)過陽性藥物、BMSCs以及BMSCs聯(lián)合維生素E治療后，各種炎癥蛋白均有不同程度的下降，而且BMSCs聯(lián)合維生素E治療對RANTES以及MIP-2的抑制作用要明顯優(yōu)于干細(xì)胞或維生素E單一治療組，見圖2。

Figure 1. The morphological characteristics of BMSCs. A: BMSCs cultured for 24 h; B: BMSCs cultured for 96 h; C: BMSCs cultured for 120 h. Scale bar = 200 μm.

Figure 2. The mRNA expression of inflammatory proteins in the kidney tissues.Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs model; #P<0.05 vs vitamin E or BMSCs.

3 各實(shí)驗(yàn)組血漿中炎癥蛋白的含量變化

結(jié)果顯示，AKI大鼠血漿中的炎癥蛋白顯著增加；隨著治療的進(jìn)行，除IL-10以外，各實(shí)驗(yàn)組炎癥蛋白含量均有一定程度的下降，但是下降程度普遍較小，而且，維生素E組未見顯著療效；在MIP-2的調(diào)控方面，BMSCs聯(lián)合維生素E體現(xiàn)出最佳抑制效果，見圖3。

4 各實(shí)驗(yàn)組腎臟中炎癥蛋白的含量變化

對腎臟組織中的炎癥蛋白相對含量的檢測結(jié)果可見，各實(shí)驗(yàn)組的變化趨勢與實(shí)時(shí)定量PCR的檢測趨勢基本一致，但也略有不同。單一維生素E治療僅對MCP-1和MIP-2有一定的降低作用，而對于IL-10和RANTES沒有明顯作用。陽性藥物對于MIP-2的表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響，這一結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR中的結(jié)果一致。同時(shí)，BMSCs聯(lián)合維生素E進(jìn)行治療對腎臟組織的RANTES以及MIP-2的調(diào)控存在抑制作用，也明顯優(yōu)于干細(xì)胞或維生素E的單一治療，見圖4。

Figure 3. The protein levels of inflammatory proteins in the plasma of each group.Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs model; #P<0.05 vs vitamin E or BMSCs.

Figure 4. The protein levels of inflammatory proteins in the kidney tissues.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs model; #P<0.05 vs vitamin E or BMSCs.

討 論

本課題從炎癥蛋白抑制的角度，進(jìn)一步評價(jià)BMSCs聯(lián)合維生素E對AKI的治療效果，分別檢測了血漿和腎臟組織中的MCP-1、IL-10、RANTES和MIP-2的表達(dá)水平，其中MCP-1、RANTES和MIP-2均屬于正性炎癥蛋白分子，即增強(qiáng)炎細(xì)胞活性作用，而IL-10則屬于負(fù)性炎癥蛋白分子，即抑制炎細(xì)胞活性作用。隨著炎癥反應(yīng)程度的增強(qiáng)，正性炎癥蛋白分子的表達(dá)量會(huì)逐漸升高，由于機(jī)體的代償作用，負(fù)性炎癥蛋白分子也會(huì)隨之上調(diào)。在經(jīng)過一系列治療后，炎癥反應(yīng)得到緩解，正性炎癥蛋白分子的表達(dá)量也會(huì)逐漸下降，同時(shí)，負(fù)性炎癥蛋白分子在達(dá)到一定程度后也會(huì)逐漸下降，恢復(fù)到正常水平。所以，正性炎癥蛋白分子與負(fù)性炎癥蛋白分子在本研究中體現(xiàn)了較為相似的變化趨勢。

在本課題中，選取地塞米松作為陽性藥物對急性腎損傷進(jìn)行治療，而且取得了一定療效。作為一種糖皮質(zhì)激素，地塞米松被廣泛用于腎損傷的臨床治療。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究方面，地塞米松也可用于多種類型腎損傷(缺血再灌注損傷、環(huán)孢素A腎毒性損傷、硝酸雙氧鈾損傷和慶大霉素?fù)p傷等)的治療，而且均取得了一定療效[12]。所以，本課題選用地塞米松作為陽性藥物，雖然與造模組相比發(fā)揮了一定的治療效果，對某些炎癥蛋白分子有一定的調(diào)控作用，但地塞米松并非對所有的炎性蛋白都具有調(diào)節(jié)作用，本課題中，該藥物對腎臟組織中的MIP-2沒有明顯的調(diào)控作用，而對血漿中的MIP-2有一定的調(diào)節(jié)。

維生素E作為一種抗氧化劑，對氧自由基造成的損傷具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，但是并不能直接起到抑制炎癥反應(yīng)的作用，所以，本課題中的維生素E治療組在炎癥抑制方面并未表現(xiàn)出明顯的抑制作用，對很多炎癥蛋白的抑制強(qiáng)度與其它治療組相比，仍然具有較大的差距。BMSCs在腎損傷治療方面的作用也被多個(gè)課題組證實(shí)[6-8,13]，而且，間充質(zhì)細(xì)胞本身就具有分泌多種調(diào)控蛋白，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)的功能，所以，本課題中的BMSCs治療組也有較好的療效，而且，對某些炎癥蛋白分子的調(diào)控作用優(yōu)于陽性藥物組。

目前，課題組已經(jīng)證實(shí)：維生素E對BMSCs的增殖、分泌功能均無明顯的影響，二者聯(lián)合的優(yōu)化作用可能是單獨(dú)作用結(jié)果的疊加，而非二者的協(xié)同作用[11]。同時(shí)，在炎癥抑制方面，維生素E只能通過抗氧自由基途徑緩解腎損傷癥狀，對炎癥反應(yīng)無直接作用；而BMSCs則可以通過多種途徑參與腎臟損傷修復(fù)，并可直接抑制炎癥反應(yīng)，緩解炎癥介質(zhì)導(dǎo)致的腎損傷。由于作用途徑的不一致，BMSCs聯(lián)合維生素E的治療模式在某些炎癥介質(zhì)的抑制方面，效果優(yōu)于單一的干細(xì)胞或維生素E的治療模式，但是，尚無直接研究結(jié)果表明二者在炎癥抑制方面存在協(xié)同作用，本文中的聯(lián)合優(yōu)化效果仍然可能是二者單獨(dú)作用的結(jié)果，對此，尚有待進(jìn)一步的驗(yàn)證和分析。

總的來講，本課題從抑制炎癥介質(zhì)的角度，評價(jià)了BMSCs聯(lián)合維生素E對AKI的治療效果。結(jié)果表明，與單一的治療模式相比，BMSCs聯(lián)合維生素E對某些炎癥蛋白具有更強(qiáng)的抑制效果。但是，本課題中所用干細(xì)胞和維生素E的劑量還比較單一，最佳的作用劑量和作用模式以及深入的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索和研究。

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