柳明玉，孫 飛，蒙裕歡，田 帥，陳軍輝，杜紅麗

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是人類最常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病，由遺傳和環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果，以胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能衰竭為主要特征，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明[1]。在過去的二十年里，T2DM的人數(shù)正在迅速增加，其發(fā)病率接近6%[2]。隨著人口老齡化及肥胖人數(shù)的增多，到2025年，全球T2DM患者人數(shù)將增至3億[3]。 T2DM迅速成為21世紀(jì)全球性最大的健康問題之一，同時這一疾病也引起了與其相關(guān)的并發(fā)癥的迅速蔓延，如缺血性心臟疾病、中風(fēng)、神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變、腎病變等[4]。近年來，隨著候選基因技術(shù)的不斷完善，尤其是全基因組相關(guān)性分析(GWAS)及SNP技術(shù)的發(fā)展，已鑒定出多種糖尿病易感基因及與T2DM密切相關(guān)的SNP位點[5-15]，這些位點的鑒定為揭示T2DM的發(fā)病機(jī)制提供大量信息，以便更好的預(yù)防，診斷和治療該疾病[16]。但由于缺少理想T2DM的動物模型，該病的分子機(jī)制仍未被完全闡明。因此，構(gòu)建與人類T2DM發(fā)病進(jìn)程相似的T2DM動物模型對于新藥開發(fā)、發(fā)病機(jī)理的研究具有極大的應(yīng)用價值[16]。食蟹猴的遺傳背景與人的高度相似，其T2DM模型能較好地模擬人T2DM發(fā)病進(jìn)程，但自發(fā)性的食蟹猴T2DM發(fā)病比率很低[17]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足研究需求。因此，本研究以人37個T2DM易感SNP位點為基礎(chǔ)，分析食蟹猴對應(yīng)基因組區(qū)域SNP與食蟹猴T2DM的關(guān)聯(lián)性，以篩查食蟹猴T2DM易感SNP標(biāo)記，篩出的這些標(biāo)記可能對于食蟹猴T2DM模型的構(gòu)建具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 血液樣品

83只食蟹猴血樣分別由廣東藍(lán)島生物科技有限公司(中國廣東)，廣東高要市康達(dá)實驗動物科技有限公司(中國廣東)和云南金杰康生物科技有限公司(中國云南)提供。所有食蟹猴樣本(許可證號SCXK(粵)2014-0010)在直系三代內(nèi)均無親緣關(guān)系，并單獨飼養(yǎng)于70 cm×70 cm×80 cm大小的籠子內(nèi)，環(huán)境溫度為25°C左右，相對空氣濕度為50%～80%,每天12 h光照，12 h黑暗。每只食蟹猴喂食蘋果100 g/d(飼料研究所，廣東省廣州市)，每天兩次，并允許自由飲水。從上述三個公司采集的樣品數(shù)目分別為83(包括35個自發(fā)和48個誘導(dǎo)個體)。所有樣品被分為4個大組(兩個自發(fā)組和兩個誘導(dǎo)組)，根據(jù)空腹血糖和糖化血紅蛋白值，每個大組分為T2DM組和對照組(正常的個體)，其中同時滿足空腹血糖≥108 mg/dL和糖化血紅蛋白≥6% 定義為T2DM個體，同時滿足空腹血糖 ≤90 mg/dL和糖化血紅蛋白≤5% 定義為正常個體。所有實驗食蟹猴樣本均獲得隸屬廣東藍(lán)島生物科技有限公司的機(jī)構(gòu)動物管理及使用委員會審批，并受到該機(jī)構(gòu)的監(jiān)督。

1.2 實驗儀器與試劑

1.2.1 實驗儀器：基因擴(kuò)增儀：Bio-Rad Tetrad 2；紫外可見光成像系統(tǒng)：美國UVP公司 3UV Transilluminator；凝膠成像系統(tǒng)：Bio-Rad；恒溫水浴鍋：宏華儀器HH-4

1.2.2 實驗試劑：PCR Taq Mix，購自廣州東盛生物科技有限公司；DL2000 marker，購自廣州東盛生物科技有限公司；瓊脂糖干粉，購自Biowest；溴化乙錠(EB)，購自廣州普博欣生物試劑公司；Proteinase K，購自寶生物工程(大連)有限公司；無水乙醇，購自天津大茂化學(xué)儀器廠；1.5 mL離心管(RNA-free)，購自廣州普博欣生物試劑公司；EDTA-2K抗凝管，購自湖南瀏陽市醫(yī)用儀具廠；槍頭(RNA-free)和一次性注射器(5 mL)，均購自廣州普博欣生物試劑公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取和DNA池的準(zhǔn)備：基因組DNA采用北京普博生物科技有限公司的試劑盒進(jìn)行抽提，提取的DNA基因組使用分光光度計測其濃度，然后統(tǒng)一稀釋至10 ng/μL，分別取等體積等濃度的30個樣品，組成A池(T2DM的個體混合基因組)和B池(正常個體混合基因組)。

1.3.2 SNP選擇和序列下載：本研究分別以人類已報道的37個T2DM易感突變位點為中心，在人類基因組上下游截取1 000 bp，并用這些序列同源比對下載食蟹猴基因組對應(yīng)區(qū)域的序列(表1)。

表1 37個對應(yīng)食蟹猴同源序列信息表

rs10440833chr420877696208797132018rs10946398chr420848321208503262006rs4457053chr673913548739155431996rs8042680chr767375033673770091977rs896854chr899911399999133711973rs4506565chr91126129631126149822020rs7901695chr91126109891126129081920rs7903146chr91126152771126172401964rs243021chr1359495737594976701934rs5215ch1454738484547404882005rs5219ch1454737542547395422001rs231362ch14256359125655801990rs1387153ch1491763645917656381994rs1552224ch1470694887706971792293rs2237892ch14275430227563162015rs2237895ch14277229927742731975rs2237897ch14277362427756992076rs2383208chr1556737112567388271716rs10811661chr1556735381567373721992rs10965250chr1556736182567379791798rs7578326scaffold397255599576212023rs1111875scaffold54822062242082292006rs5015480scaffold54822089462109201975rs11634397scaffold819635269372712003rs5945326C129171422122792279

1.3.3 PCR擴(kuò)增及測序：根據(jù)已下載的食蟹猴序列，設(shè)計37對引物,引物序列見表2。引物由上海生工生物工程公司合成。以上述的A池和B池為模板，通過PCR擴(kuò)增目的片段，PCR產(chǎn)物送華大基因測序。篩選出A池和B池測序存在顯著性差異SNP的引物，以83個體基因組為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增DNA片段(表3)。

1.3.4 基因分型和等位基因頻率：以83個個體基因組為模板，五對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，利用DNAStar軟件分析堿基之間的差異性，同時計算等位基因間的頻率。

1.3.5 關(guān)聯(lián)分析：基因頻率差異采用方差分析和F檢驗[18]，基因型與空腹血糖值和糖化血紅蛋白值之間的關(guān)聯(lián)分析采用SAS的GLM模型，基因型為固定效應(yīng)，兩種分析都規(guī)定P<0.05表示差異顯著性，P<0.01表示差異極顯著。

表2 PCR擴(kuò)增引物序列

注：a退火溫度b在對照組和疾病組樣本中未成功擴(kuò)增出目的片段的引物序列

NoteaAnnealing temperature，bPrimers can’t amplified the expected DNA fragments between case and control individuals.

表3 PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果

2.1 PCR和測序

本研究共設(shè)計了37對引物，其中有5對引物擴(kuò)增的片段在自發(fā)的T2DM組和對照組中存在很大差異，見圖1。這5對引物分別命名為mf-56(3個SNP),mf-66(2個SNP),mf-14(3個SNP),mf-34(4個SNP),mf-32(1個SNP)，采用上述5對引物，以83個個體基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，分析13個SNP在四個大組中的差異。

A：T2DM個體混合基因組，B：正常個體混合基因組

2.2 基因分型和等位基因頻率

每個SNP等位基因在T2DM組和對照組之間的分布差異以及與T2DM的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明，在金杰康自發(fā)群體中，SNPmf-66A和SNPmf-66B 在T2DM組和對照組之間的等位基因頻率差異顯著(P<0.05),同時這兩個位點的基因型與空腹血糖值之間也存在顯著關(guān)聯(lián)性(type IIIP<0.05),(表4)。在藍(lán)島自發(fā)群體中，SNPmf-34A、SNPmf-34B、 SNPmf-34C、SNPmf-56A, SNPmf-56B和SNPmf-56C在T2DM組和對照組之間等位基因頻率也存在差異顯著性(P<0.05)，其中SNPmf-34A、SNPmf-34B、SNPmf-34C位點的基因型與空腹血糖值之間存在極顯著關(guān)聯(lián)性(type IIIP<0.01),(表5)。在云南金杰康和廣東藍(lán)島所有自發(fā)群體中，SNPmf-66B、SNPmf-34A、SNPmf-34B在T2DM組和對照組之間的等位基因頻率存在顯著性差異(P<0.05)，SNPmf-34A、SNPmf-34B、SNPmf-34C位點的基因型與空腹血糖之間存在顯著性關(guān)聯(lián)(type IIIP<0.05)，(表6)。并且，這13個SNP位點與糖化血紅蛋白之間無顯著性關(guān)聯(lián)性。此外，在誘導(dǎo)群體中，這13個SNP位點的等位基因頻率在T2DM組和對照組之間均無顯著性差異，且與空腹血糖和糖化血紅蛋白也無顯著性關(guān)聯(lián)(P>0.05)。

在自發(fā)性T2DM群體中，我們篩查出與人的T2DM易感基因rs10811661和rs1531343對應(yīng)的食蟹猴基因組上同源區(qū)域內(nèi)有5個SNP位點即SNPmf-66A、SNPmf-66B、SNPmf-34A，SNPmf-34B， SNPmf-34C有可能是食蟹猴2型糖尿病模型制備的遺傳標(biāo)記。

表4 SNP位點等位基因頻率在金杰康自發(fā)組中的分布及其基因型與空腹血糖的關(guān)聯(lián)性

表5 SNP位點等位基因頻率在藍(lán)島自發(fā)組中的分布及其基因型與空腹血糖的關(guān)聯(lián)性

表6 SNP位點等位基因頻率在所有自發(fā)個體中的分布及其基因型與空腹血糖的關(guān)聯(lián)性

3 討論

由于T2DM及其并發(fā)癥的迅速蔓延已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性難題，為了找到能有效防治糖尿病及其并發(fā)癥的藥物或方法，相關(guān)動物模型則是必不可少的重要工具[19]。研究發(fā)現(xiàn)食蟹猴T2DM在發(fā)病前也經(jīng)過類似人類T2DM的胰島素抵抗、糖代謝異常、高胰島素血癥等階段。在所有的實驗動物中非人靈長類的血糖值最符合人的血糖值范圍[16]。另外，人類T2DM患者中90%都發(fā)生了胰島淀粉化，非人靈長類動物與人類T2DM臨床病理特征最相似的地方就是胰島淀粉樣沉積，多種非人靈長類動物(恒河猴、黑猴、食蟹猴以及豚尾猴等)自發(fā)T2DM都具有這一特征，又因食蟹猴來源廣泛，并且具有繁殖周期短，性格溫順，用藥量少等優(yōu)勢，因此，食蟹猴T2DM模型成為T2DM病因、病理研究比較理想的動物模型之一[17]。

相對于其他動物，食蟹猴的遺傳背景與人的更接近[20]，已測的食蟹猴的基因組的數(shù)據(jù)顯示，它的基因組與人的同源性達(dá)約94%。因此從理論上來說，食蟹猴與人之間具有更多共同的T2DM相關(guān)基因，本項目基于人類已有的T2DM易感突變位點，采用基因關(guān)聯(lián)分析等方法在食蟹猴基因組對應(yīng)區(qū)域篩查與食蟹猴T2DM相關(guān)的遺傳標(biāo)記是可行的。

Rs10811661位于易感基因CDKN2A/CDKN2B上游124 kb左右，在法國人群[21]和中國漢族人群[22]中都證實了rs10811661位點與2型糖尿病具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，同時rs10811661中T等位基因在韓國人群中也證實了與2型糖尿病的緊密相關(guān)性(OR=1.47, 95 % CI=1.23-1.75, p=2.1 × 105)[23]。CDKN2A和CDKN2B是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制基因，位于9號染色體短臂上。CDKN2A抑制細(xì)胞周期素依賴激酶4(CDK4)，而CDK4是胰腺β細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Rs10811661有T和C兩種等位基因，當(dāng)C突變成T時，CDKN2A/CDKN2B基因表達(dá)增多，對CDK4抑制作用增強(qiáng)，造成β細(xì)胞功能受損。易感基因HMGA2 rs1531343在日本人群中被證實是與2型糖尿病相關(guān)的多態(tài)性位點[24]。該位點主要影響胰島素分泌[25]，且與空腹血糖之間有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。

本實驗篩查出的SNPmf-66A、SNPmf-66B 和SNPmf-34A、SNPmf-34B、SNPmf-34C這些位點分別位于與人的T2DM易感基因rs10811661和rs1531343對應(yīng)的食蟹猴基因組上同源區(qū)域內(nèi)，因此，我們推測這些位點有可能是食蟹猴T2DM模型制備的遺傳標(biāo)記。而在誘導(dǎo)群體中，13個SNP的基因頻率在T2DM組和對照組之間沒有顯著性差異，分析其可能的原因是與自發(fā)性個體相比，誘導(dǎo)的T2DM個體具有不同的分子遺傳學(xué)機(jī)制。這些遺傳標(biāo)記對揭示T2DM的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)食蟹猴T2DM模型提供一種新的策略。

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