李亞文，徐世元，張慶國，李 樂，賴露穎，鄭 艇，蘇嬌玲，楊耐梅，李元濤

（1.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院麻醉科，廣州 510282；2.南方醫(yī)科大學附屬深圳婦幼保健院麻醉科，廣東深圳 518028）

長期以來，過表達microRNA質(zhì)粒可直接用于細胞系轉染表達，是研究基因功能的重要方法。但用真核細胞構建的表達載體在細胞轉染階段存在轉染率不高且周期長等弊端，限制其廣泛應用；而慢病毒載體是以人類免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎發(fā)展起來的基因治療載體，它既能感染分裂細胞又能感染非分裂細胞，安全性高并可以在體內(nèi)較長期地表達。本實驗所用慢病毒載體感染目的細胞后不再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。

本研究通過構建Grp78基因過表達慢病毒表達載體，為下一步感染SH－SY5Y細胞株，進而研究Grp78在布比卡因神經(jīng)毒性所致細胞凋亡和細胞損傷中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）主要試劑：瓊脂糖、PCR試劑盒、Taq polymerase，dNTP、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒抽提試劑盒。臺盼藍、胰酶、DMSO、DMEM、Lipofectamine 2000、細胞株：293T；菌株：大腸埃希菌菌株DH5α；病毒載體：GV 載體、pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體。（2）主要儀器：PCR儀、穩(wěn)壓DNA電泳儀、凝膠成像儀、培養(yǎng)箱、高速離心機、熒光顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增目的基因 （1）載體信息：GV261；元件順序：Ubi－MCS－IRES－Cherry；克隆位點：AgeI／NheI。（2）目的基因片段Grp78引物，上游：5′－CGG GTA CCG GTC GCC ACC ATG AAG CTC TCC CTG GTG G－3′；下 游：5′－AGT CGC TAG CCT ACA ACT CAT CTT TTT CTG CTG TAT C－3′。

1.2.2 制備感受態(tài)細胞及轉化 CaCl2法制備感受態(tài)細胞進行轉化實驗步驟如下：（1）各取每種感受態(tài)細胞懸液200μL轉移至無菌微量離心管中，每管加入連接液10μL，輕輕旋轉以混勻，然后置冰中放置30min。制備感受態(tài)細胞，使其具有攝取外源DNA的能力。（2）42℃熱休克90s?？焖賹⒐苻D移到冰浴中冷卻細胞1～2min。每管加入800μL LB培養(yǎng)基。水浴加溫至37℃，然后放置搖床溫育45min以復蘇細菌。（4）將150μL轉化感受態(tài)細胞轉移到AMP（100μg／mL）抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基上。把平板置于室溫直至液體被吸收。然后倒置平皿，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。（5）克隆進行后續(xù)PCR鑒定。

1.2.3 重組質(zhì)粒構建 PCR產(chǎn)物連接入線性化表達載體反應體系見表1，反應條件 ：25℃30min；42℃15min。

1.2.4 Lentivirus病毒包裝 消化293T細胞，調(diào)整其密度為每20mL有1.2×107個細胞，接種細胞于培養(yǎng)皿中，放置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞密度達70%～80%時可用于細胞轉染。細胞狀態(tài)對于病毒包裝至關重要，需要保證良好的細胞狀態(tài)和較少的傳代次數(shù)。轉染前2h將含胎牛血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。向一離心管中加入制備的各DNA溶液（pGC－LV 載 體20μg、pHelper 1.0 載體15μg、pHelper 2.0載體10μg）與相應體積培養(yǎng)基混合均勻，調(diào)整總體積為2.5mL，室溫下溫育5min。將Lipofectamine 2000試劑輕柔搖勻，取100μL Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2.4mL Opti－MEM培養(yǎng)基混合，室溫下溫育5min。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進行混合，輕顛混勻，避免振蕩，且須5min內(nèi)混合。混合后室溫下溫育20min，然后將混合液轉移至293T細胞培養(yǎng)液中，混合均勻，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8h后倒去培養(yǎng)基，每瓶細胞加入20mL磷酸鹽緩沖液（PBS），以洗滌殘余混合液，移去混合液。每瓶細胞中加入含10% 胎牛血清培養(yǎng)基25mL，放置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2d。

表1 PCR反應體系

1.2.5 Lentivirus滴度測定

1.2.5.1 樣品制備 293T細胞傳代，24孔中每個孔加入1×105個細胞，體積為500μL；次日準備10個無菌Ep管，每管中加90μL培養(yǎng)基；取待測病毒原液10μL加入到第一個管中，混合均勻，取混合均勻的第一管液10μL加入到第二個管中繼續(xù)相同的操作直到最后一管；選取所需細胞孔，吸去90μL培養(yǎng)基。加稀釋好的病毒溶液，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；1d后，加入新鮮培養(yǎng)基500μL。小心操作；4d后抽提RNA。

1.2.5.2 總RNA抽提 去細胞上清液，每孔加入1mL Trizol，吹打，室溫靜置5min，轉移至另一新1.5mL Ep管中。每管加200μL氯仿，用力震蕩15s，室溫下靜置15min。4℃下12000r／min離心15min。從每管中吸取上清液至另一新1.5 mL Ep管中。加入等體積－20℃預冷的異丙醇，混勻后－20℃沉淀10min。4℃下12000r／min離心10min，移去上清液。加入1mL 4℃預冷的75%乙醇，洗滌沉淀及離心管壁。4℃下10000r／min離心5min，移棄上清液。4℃下10000 r／min再次離心5min，吸去殘液，室溫下干燥，不需完全干燥。加20μL無RNA酶（RNase）水至完全溶解，紫外分析測定所抽提RNA濃度。

1.2.5.3 RNA逆轉錄獲cDNA 將1μL Oligo dT（0.5μg／μL）和2.0μg總RNA加入PCR小管，補焦碳酸二乙酯（DEPC）水至9μL。混合均勻、離心，70℃溫浴10min。緊接著插入到0℃冰水浴中。按下表比例，根據(jù)反應管數(shù)算出所需試劑量。將M－MLV酶等在冰上混勻得到逆轉錄反應液。在每個反應管中加11μL逆轉錄反應液，混合均勻后離心。其中，11μL逆轉錄反應液含5×逆轉錄緩沖液4μL、10mmol／L dNTPs 2μL、RNA 抑制劑 0.5μL、M－MLV－RTase 1μL、DEPC水3.5μL。在42℃進行1h完成逆轉錄反應，后用70℃處理10min使逆轉錄酶失活。逆轉錄反應產(chǎn)物cDNA可用于PCR，也可－80℃長期保存。

1.2.5.4 實時定量PCR檢測 實時定量PCR在Takara的TP800PCR儀上完成。配置反應體系：每管加入SYBR premix ex Taq 10μL、上游引物（5μmol／L）1.0μL、下游引物（5μmol／L）1.0μL、cDNA 1.0μL、ddH2O 7.5μL。設定程序為兩步法實時定量PCR。預變性95℃5s；變性95℃5s，退火60℃30s，延伸60℃30s，40個循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值，用于制作熔解曲線。PCR結束后，在95℃變性1 min。然后冷卻至55℃，使DNA雙鏈充分聚合。從55℃開始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30s，同時讀取吸光值。兩個循環(huán)后將調(diào)定點升高0.5℃。

2 結 果

2.1 重組質(zhì)粒構建結果 陽性轉化子PCR產(chǎn)物大?。?10 bp，見圖1。

圖1 PCR鑒定轉化結果電泳圖

2.2 病毒的收獲及濃縮 收集轉染后2d的293T細胞上清液。4℃、4000×g離心10min，以除去細胞碎片。用0.45 μm過濾器過濾上清液到40mL超速離心管中。把病毒粗提液樣品加入過濾杯中。將過濾杯插到濾過液收集管中，再4000×g離心至所需病毒濃縮體積，時間15min。離心結束后取出離心裝置，將過濾杯和濾過液收集杯分開。將過濾杯倒扣在樣品收集杯上，離心力不超過1000×g，時間2min。過高轉速會使樣品損失。把過濾杯從樣品收集杯上移開。樣品收集杯中即為病毒濃縮液。將病毒濃縮液移出，進行分裝；取其中一支進行滴度測定，其余置－80℃長期保存。

2.3 實時定量PCR法測定綠色熒光蛋白標記的慢病毒滴度

圖2 實時定量PCR曲線圖

2.3.1 引物信息 綠色熒光蛋白（GFP）引物：被擴增的片段位于211～496bp之間，其上游引物序列為5′－TGC TTC AGC CGC TAC CC－3′，熔點Tm為57.4℃，GC百分含量為64.7%。下游引物序列為5′－AGT TCA CCT TGA TGC CGT TC－3′，熔點Tm為57.3℃，GC百分含量為50.0%。β－actin被擴增的片段位置位于932～1233bp之間，其上游引物序列為5′－GTG GAC ATC CGC AAA GAC－3′，熔點 Tm 為52.6℃，GC百分含量為55.6%。下游引物序列為5′－AAA GGG TGT AAC GCA ACT A－3′，熔點Tm為51.0℃，GC百分含量為42.1%。

2.3.2 實時定量PCR結果 在該次病毒滴度檢測中，1.00E－03μL組樣品與對照組樣品的Ct值差異大于3以上，故認定病毒顆粒存在于1.00E－03μL組樣品中。見圖2。

2.4 β－actin、GFP熔解曲線 見圖3。

圖3 β－actin、GFP熔解曲線

3 討 論

通過慢病毒載體的構建、包裝，得到穩(wěn)定表達的質(zhì)粒；該質(zhì)粒能有效應用于研究Grp78基因過表達來減少細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應［1］。該質(zhì)粒較采用真核細胞轉染得到的質(zhì)粒感染細胞的成功率高［2－3］。觀察 GFP表達情況［4－5］，在加入 1E－5μL病毒原液的孔中觀察到3個細胞存活，說明該孔中至少有3病毒顆粒感染細胞，且認為該病毒的滴度等于帶有熒光的細胞數(shù)除以病毒原液量。在加入1E－6μL病毒原液的孔中觀察到2個帶有熒光的細胞，說明該孔中至少有2個病毒顆粒感染細胞，且認為該病毒的滴度等于帶有熒光的細胞數(shù)除以病毒原液量，即2／（1E－6）＝2E＋6，單位為 TU／μL，也就等于2E＋9 TU／mL。

加入不同病毒量的細胞樣品，通過提取總RNA后反轉錄為cDNA，然后進行定量PCR檢測，通過對照組與實驗組的Ct值差異來判斷滴度值。通常情況下認為Ct值差異2以上存在顯著差異［6］。反轉錄反應所獲得20μL cDNA中只取1μL用于實時定量PCR檢測，該結果僅表示1／20樣品的情況，所以在滴度計算時乘以系數(shù)20。

退火溫度偏低，可引起非特異性擴增。適當提高退火溫度可降低非特異性擴增。故通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。非特異性條帶的出現(xiàn)，原因諸多，引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體、退火溫度過低、PCR循環(huán)次數(shù)過多等。針對解決措施有降低引物量、減少循環(huán)次數(shù)、適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。熔解曲線中，由于SYBR GreenⅠ與所有雙鏈DNA相結合，引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量精確性。故由熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一性更有助于準確分析SYBR Green實時定量 PCR 結果［7－13］。

設立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴增條帶的最低量標準病原體核酸為宜，注意交叉污染可能。每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。PCR結束后，根據(jù)發(fā)生過程中熒光值變化繪出每個樣品的熔解曲線。熔解曲線是擴增反應的質(zhì)控途徑，圖中沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬，表明實驗中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴增。不同的擴增產(chǎn)物因為其長度和GC含量不同而在不一樣的溫度下解鏈，當產(chǎn)物解鏈時，SYBR GreenⅠ的熒光值將降低并被儀器所監(jiān)測。繪制熔解曲線時，需實時定量PCR儀連續(xù)監(jiān)測每個樣品在從雙鏈完全配對到完全解鏈的升溫過程中熒光值的變化，由此繪制出熒光強度隨溫度變化的負一次倒數(shù)圖。熒光強度變化的拐點（熔點，Tm）即為熔解峰值。Grp78過表達病毒載體的構建和包裝成功，為今后研究Grp78基因在布比卡因所致神經(jīng)細胞損傷中的作用奠定基礎，進而為布比卡因神經(jīng)毒性的防治打開一扇科學之門。

［1］李亞文，徐世元，張慶國，等.高糖環(huán)境誘導SH－SY5Y細胞ROS爆發(fā)－內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激增強布比卡因神經(jīng)毒性［D］.廣州：南方醫(yī)科大學，2013.

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