樊惠，馮慧利，黨惠子，陳曉培，任映，楊金鐸，王蓬文

(國家中醫(yī)藥管理局三級實驗室北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥藥理學(xué)實驗室；北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點實驗室，北京 100700)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是癡呆最常見的類型，也是導(dǎo)致老年人群發(fā)病和死亡的主要原因之一。2005年全世界AD發(fā)病人數(shù)已高達2430萬，并且還在以每年460萬的速度增加，預(yù)計到2040年將會達到8110萬，且絕大多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國家(約占70%)[1]。AD發(fā)病最大的危險因素是年齡[2]，隨著各國人口老齡化，AD引發(fā)的醫(yī)療和社會經(jīng)濟負擔(dān)在未來幾十年會逐年攀升，目前對AD的治療藥物多為對癥治療，急需開發(fā)針對病因、早期阻斷AD發(fā)展的更有效的治療藥物(disease-modifying drugs)。研究表明鳥嘌呤核苷具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用，包括星形膠質(zhì)細胞增生，促進軸突的生長，增加合成和釋放神經(jīng)/多效蛋白如神經(jīng)生長因子、TGF-β和基本成纖維細胞生長因子[3,4]。因此，鳥苷可能在神經(jīng)炎性/神經(jīng)變性疾病，特別是AD的治療中是一種極具療效的潛在藥物。

本研究采用動物模型為APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠，該模型是國際公認的研究AD的基因修飾模型，該模型的特點是短期內(nèi)產(chǎn)生大量的Aβ，發(fā)生擬AD的病理改變，研究表明3.5月齡的APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)空間記憶障礙，伴有明顯降低乙酰膽堿、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶[5]。以膽堿酯酶抑制劑鹽酸多奈哌齊為陽性對照，同時選用以往課題證明對神經(jīng)有保護作用的姜黃素為中藥治療組[6]，通過水迷宮檢測行為學(xué)改變，觀察鳥嘌呤核苷和姜黃素對小鼠行為學(xué)影響，初步探討鳥嘌呤核苷、姜黃素對AD早期學(xué)習(xí)記憶的影響，為探尋防治AD的潛在靶標提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

姜黃素[6]；鹽酸多奈哌齊為衛(wèi)材藥業(yè)有限公司制造，中國，批號H20050978；鳥嘌呤核苷為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，批號G6264；羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose，CMC)為北京精求化工有限責(zé)任公司，批號為3405005。MD-021小鼠Morris水迷宮，上海移碼數(shù)字有限公司(中國)。

1.1.2 實驗動物

SPF級APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠60只和C57/BL6J小鼠12只，均為3月齡雄性小鼠，體重25～30 g。均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所[SCXK(京)2009-0004]，于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動物室[SYXK(京)2009-0028]飼養(yǎng)。所有動物在實驗中自由攝食和飲水。實驗操作程序均通過東直門醫(yī)院實驗動物倫理委員會和使用管理委員會批準(批準號為2013-09)。

1.2 方法

1.2.1 分組和給藥

隨機將3月齡APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠分為模型組、鹽酸多奈哌齊組、鳥嘌呤核苷組、姜黃素組、姜黃素鳥苷組，每組12只，每天給藥1次，連續(xù)給藥1個月。鹽酸多奈哌齊組，鹽酸多奈哌齊0.92 mg/(kg·d)灌胃和等體積的生理鹽水腹腔注射；鳥嘌呤核苷組，鳥嘌呤核苷20 mg/(kg·d)腹腔注射和等體積的0.5% CMC灌胃；姜黃素組，姜黃素200 mg/(kg·d)灌胃和等體積的生理鹽水腹腔注射；姜黃素鳥苷組，鳥嘌呤核苷20 mg/(kg·d)腹腔注射和姜黃素200 mg/(kg·d)灌胃；選用同月齡C57/BL6J小鼠為正常對照組，該組和模型組給予等體積0.5%灌胃和等體積生理鹽水腹腔注射。

1.2.2 Morris 水迷宮測試

Morris水迷宮檢測小鼠的定位航行和空間搜索等學(xué)習(xí)記憶和記憶保持能力[6]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 鳥嘌呤核苷、姜黃素對4月齡AD小鼠定位航行能力的影響

隨訓(xùn)練次數(shù)增加，各組小鼠的逃避潛伏期中間有波動，但整體呈下降趨勢。第4天，與模型組相比，正常對照組小鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)；治療組與模型組小鼠相比逃避潛伏期相比減短(P<0.05)。第5天，與正常對照組相比，模型組小鼠逃避潛伏期明顯減短(P<0.01)，模型組小鼠逃避潛伏期與姜黃素組、姜黃素鳥苷組相比延長(P<0.05)(表1)。

表1 鳥嘌呤核苷、姜黃素對4月齡AD小鼠逃避潛伏期的影響 ±s，n=12)

2.2 鳥嘌呤核苷、姜黃素對4月齡AD小鼠空間探索能力的影響

隨著訓(xùn)練時間的延長,各組小鼠的游泳距離而有所減少，中間略有的波動。第3天，模型組游泳距離比正常組明顯延長(P<0.01)，治療各組游泳距離比模型組有所減少(P<0.05)，而姜黃素鳥苷組游泳距離則明顯減少(P<0.01)。第4、5天，模型組游泳距離比正常組均明顯延長(P<0.01)，姜黃素組、姜黃素鳥苷與模型組相比，游泳距離均減少(P<0.05)(表2)。

表2 鳥嘌呤核苷、姜黃素對4月齡AD小鼠空間探索能力的影響±s，n=12)

2.3 鳥嘌呤核苷、姜黃素對AD雙轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶和記憶保持能力的影響

撤臺實驗小鼠穿越平臺次數(shù)：與正常對照組比，模型組小鼠120 s內(nèi)穿越平臺次數(shù)顯著減少(P<0.01)；與模型組比，鳥苷組、鹽酸多奈哌齊組、姜黃素鳥苷組穿越平臺次數(shù)穿越次數(shù)有所增加(P<0.05)，姜黃素組則顯著增加(P<0.01)。撤臺后小鼠的目標象限停留時間結(jié)果與穿越平臺次數(shù)基本一致(表3)。

表3 鳥嘌呤核苷、姜黃素對APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠穿越平臺次數(shù)的影響 ±s，n=12)

3 討論

鳥苷(guanosine)是核苷的一種，是由鳥嘌呤與核糖(呋喃核糖)環(huán)組成。鳥苷經(jīng)過磷酸化之后可變成鳥苷單磷酸(GMP)、環(huán)鳥苷單磷酸(cGMP)、鳥苷雙磷酸(GDP)或鳥苷三磷酸(GTP)。若鳥苷與脫氧核糖相連，則會產(chǎn)生脫氧鳥苷。鳥苷的用途十分廣泛，磷酸化產(chǎn)物可以作為激素的第2信使，在細胞內(nèi)發(fā)揮激素調(diào)節(jié)生理機能和物質(zhì)代謝作用，能改變細胞膜的功能，對糖、脂肪代謝、核酸、蛋白質(zhì)的合成調(diào)節(jié)等起著重要的作用。鳥嘌呤核苷是一種分布在大腦細胞外的嘌呤核苷，在生理和病理條件其濃度甚至高于其有較多認識的同類嘌呤核苷—腺苷。我們實驗結(jié)果顯示，結(jié)果顯示，對AD雙轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)的學(xué)習(xí)記憶障礙，鳥嘌呤核苷有改善作用，Aβ除了是AD的致病因素，正常情況下它們在大腦中也會少量的產(chǎn)生，一些證據(jù)表明它們可以調(diào)節(jié)突觸可塑性和記憶功能[7]。有研究證實在用Aβ42處理的人成神經(jīng)母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞中，鳥苷能明顯降低Aβ42引起的早期氧化反應(yīng)物的形成，也能夠抑制細胞內(nèi)外的Aβ42的釋放和抑制β分泌酶的活性[8]，體外實驗證實鳥嘌呤核苷保護大鼠星形膠質(zhì)細胞，抵抗星形孢菌素誘導(dǎo)的細胞星形膠質(zhì)細胞凋亡和對抗β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞的凋亡，在這兩種情況下，鳥嘌呤核苷的抗凋亡作用是由磷脂酰肌醇3 -激酶(PI3K)/ Akt蛋白和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)細胞的生存通路介導(dǎo)的[9]。

姜黃素是從中藥姜黃、郁金等根莖中提取的多酚色素。研究表明姜黃素可以有效地預(yù)防和改善認知功能障礙，與它抗氧化、 抗炎并調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)等作用有關(guān)[10]，作為一種天然的抗氧化劑，其含有的酚性羥基可以直接捕獲或清除Aβ產(chǎn)生的自由基，還可通過超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物等抗氧化酶介導(dǎo)發(fā)揮抗氧化作用。體外研究表明，姜黃素抑制腦小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)，抑制Aβ寡聚體的形成和纏結(jié)，體內(nèi)研究表明，姜黃素可以逆轉(zhuǎn)Aβ造成神經(jīng)炎癥反應(yīng)[11]。我們以往的研究表明，姜黃素治療3個月或6個月可以通過改善突觸結(jié)構(gòu)、增加Aβ降解酶NEP和IDE的表達，改善胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(PI-3-K/Akt通路)和突觸后膜相關(guān)蛋白進而改善APPswe /PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[12-14]。本實驗進一步探討姜黃素灌胃治療1個月即可早期改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶和記憶保持能力。

如上所述鳥嘌呤核苷和姜黃素同樣可以通過降低Aβ和作用于PI3K/Akt通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用，本次實驗設(shè)計觀察二者疊加是否會出現(xiàn)協(xié)同作用，結(jié)果短期協(xié)同作用并不明顯，原因不明，考慮是否與β分泌酶量和通路受體結(jié)合量等因素有關(guān)。實驗選用臨床治療AD廣泛應(yīng)用的可逆的高度選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑鹽酸多奈哌齊為陽性對照，結(jié)果顯示，單獨應(yīng)用鳥嘌呤核苷、姜黃素以及兩者聯(lián)合均可改善AD小鼠的認知，尤其是姜黃素單獨使用作用明顯，與鹽酸多奈哌齊相比無顯著差異，由此得出鳥嘌呤核苷和姜黃素雖改善AD小鼠空間探索和記憶保持能力，從而改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，作用機制有待進一步研究。

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