夏東暉，曹幸毅，王靜宇，袁明，吳士文

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院，新鄉(xiāng)市 453003；

2.中國人民武裝警察部隊總醫(yī)院，北京市 100039；

3.中國航天員科研訓練中心，航天醫(yī)學基礎(chǔ)與應用國家重點實驗室，北京市 100094)

內(nèi)皮細胞損傷是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)生的始動因素之一，持續(xù)的高血糖可誘導血管內(nèi)皮細胞損傷甚至凋亡[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是細胞應對有害刺激時的一種保護性調(diào)節(jié)機制，但持續(xù)或程度較強的ERS可引起血管內(nèi)皮細胞損傷及功能障礙，從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生[2-3]。先前的研究表明，雌激素可通過對抗高糖誘導的ERS調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能[4]。GPR30作為新近發(fā)現(xiàn)的雌激素受體，激動GPR30可抵抗高糖導致的內(nèi)皮細胞凋亡[5]，但這種保護作用是否通過抑制ERS相關(guān)通路尚未被闡明。本實驗應用高濃度葡萄糖干預EA.hy926內(nèi)皮細胞，觀察ERS與高糖誘導內(nèi)皮細胞凋亡的關(guān)系，研究GPR30的特異性受體激動劑G1對高糖誘導內(nèi)皮細胞ERS及凋亡的影響，探討其保護效應。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：GPR30受體激動劑G1(Sigma 公司, 美國)，Annex V細胞凋亡檢測試劑盒(BD Pharmingen公司, 美國)， 抗Bip、IRE1、PERK、Bax、Bcl-2抗體(Cell Signaling Technology公司, 美國)，Trizol(Invitrogen公司, 美國)、PCR引物(北京奧科生物技術(shù)有限公司，中國)，反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR試劑盒(TaKaRa 公司, 日本)。主要儀器：二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(NUAIRE公司, 美國)，倒置顯微鏡(Nikon TS100，日本)，實時定量PCR儀(Eppendorf 公司, 美國)，電泳系統(tǒng)(Bio-rad, 美國)，流式細胞儀(BD FACS Aria II, 美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理方法

EA.hy926內(nèi)皮細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞達80%融合狀態(tài)時，將細胞分為3組：正常對照組(Con，17.51 mmol/L 葡萄糖)、高糖組(HG，33.3 mmol/L)、高糖+G1組(HG+G1,HG+1μmol/L G1)，3組細胞同時處理24 h。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡[6]

根據(jù)實驗分組處理后，使用0.25%胰酶消化EA.hy926內(nèi)皮細胞，PBS清洗1次，1500 g離心5 min，棄上清，收集細胞(1×106細胞/組)。PBS洗3次，以結(jié)合緩沖液重懸細胞沉淀，使細胞濃度為1×106/mL，100 μL細胞懸液，加入annexinV-PE及7-AAD各5 μL，室溫避光15 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液，進行流式細胞術(shù)定量檢測。以不加annexinV-PE及7-AAD的一管作為陰性對照。凋亡及死亡的細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻以致annexin V染色陽性；而活細胞annexin V染色陰性；死亡細胞則為7-AAD染色陽性。即第一象限7-AAD +/annexin V+為死亡細胞，第二象限7-AAD +/annexin V-為機械損傷的細胞，第三象限7-AAD-/annexin V-為活細胞，第四象限7-AAD -/annexin V+為凋亡細胞。

1.2.3 RNA提取與實時定量PCR

按實驗分組處理EA.hy926內(nèi)皮細胞并用Trizol法提取各組總RNA，取RNA產(chǎn)物2 μg反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。使用Eppendorff mastercycle熒光定量PCR儀進行擴增及定量分析(表1)。

表1 PCR引物序列

1.2.4 蛋白印跡法[6]檢測ERS相關(guān)分子蛋白表達

根據(jù)實驗分組處理EA.hy926內(nèi)皮細胞，24 h后收集細胞(1×106細胞/組)，使用蛋白裂解液及超聲法提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，取30 μg蛋白加入樣品緩沖液，100℃水煮沸5 min。配制SDS-PAGE凝膠后加入樣品后進行電泳，電泳結(jié)束后通過半干電轉(zhuǎn)儀將樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下?lián)u床用含5%脫脂奶粉的TBS-T封閉1 h，以Bip、IRE1、PERK、Bax、Bcl-2、與抗體稀釋液(1∶1000)分別4℃孵育過夜。TBS-T清洗PVDF膜3次，每次10 min，然后與HRP抗兔抗體(1∶1000)室溫孵育1 h后，TBS-T清洗PVDF膜3次，每次10 min，ECL顯色系統(tǒng)X線感光顯影。用掃描儀對圖片進行掃描，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參照，進行半定量分析。

1.2.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 高糖對EA.hy926內(nèi)皮細胞凋亡的影響及G1的作用

HG組與Con組比較，細胞凋亡率明顯升高[(11.2±0.2)% vs(5.4±0.18)%，P<0.01]，差異有顯著性；HG+G1組與HG組比較，細胞凋亡率明顯降低[(7.8±0.15)% vs (11.2±0.2)%，P<0.05]，差異有顯著性。見圖1。

注：**為HG組與Con組相比差異有顯著性，P<0.01;*為HG+G1組與HG組相比差異有顯著性, P<0.05。

2.2 高糖對EA.hy926細胞凋亡相關(guān)分子和ERS相關(guān)蛋白表達的影響及G1的作用

HG組與Con組比較，Bip、IRE1、PERK及凋亡分子Bax表達上調(diào)(P<0.05,P<0.01或P<0.001)，Bcl-2的表達下調(diào)(P<0.01)，差異有顯著性；HG+G1組與HG組比較， Bip、IRE1、PERK及凋亡分子Bax表達下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2的表達上調(diào)(P<0.05)差異均有顯著性。見圖2。

注：HG組與Con組相比，Bip表達上調(diào)(P<0.001)；IRE1表達上調(diào)(P<0.05)；PERK表達上調(diào)(P<0.001)；Bax表達上調(diào)(P<0.01)； Bcl-2表達下調(diào)(P<0.01)。結(jié)果差異均有顯著性。HG+G1組與HG組相比，Bip表達下調(diào)(P<0.05)；IRE1表達下調(diào)差異有顯著性(P<0.01)；PERK表達下調(diào)(P<0.05)； Bax表達下調(diào)(P<0.01)；Bcl-2表達上調(diào)(P<0.05)結(jié)果差異均有顯著性。

2.3 高糖對內(nèi)皮細胞Bip mRNA和CHOP mRNA表達的影響及G1的作用

HG組較Con組，Bip mRNA、CHOP mRNA 表達上調(diào)(P<0.001及P<0.01)，差異有顯著性；HG+G1組與HG組比較，Bip mRNA、CHOP mRNA 表達下調(diào)(P<0.001及P<0.01)，差異有顯著性。見圖3。

注：***為HG組與Con組相比，HG+G1組與HG組相比，BIP mRNA表達變化差異有顯著性，P<0.001; **為HG組與Con組相比，HG+G1組與HG組相比，CHOP mRNA表達變化差異有顯著性, P<0.01。

3 討論

血管內(nèi)皮細胞損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生的早期事件，致動脈粥樣硬化的危險因素均可導致血管內(nèi)皮細胞損傷甚至細胞凋亡[7]。已有研究報道，高糖作為動脈粥樣硬化的危險因素，可通過誘導內(nèi)皮細胞損傷促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[8]，本研究通過流式細胞術(shù)證實持續(xù)的高糖可誘導EA.hy926內(nèi)皮細胞凋亡。

細胞凋亡主要有三條通路:死亡受體活化通路、線粒體損傷通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激啟動的凋亡通路，前兩者是經(jīng)典凋亡通路，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路是近年來才發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中蛋白質(zhì)折疊加工的主要場所。由于各種原因引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中出現(xiàn)錯誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態(tài)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。Bruno等[10]的研究表明，持續(xù)的高血糖可上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白Bip、PERK、IRE1，Bip是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中一種特征性的伴侶蛋白，其誘導表達對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激起著關(guān)鍵作用，被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號系統(tǒng)上游的開關(guān)分子，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的一種標志蛋白[11]。PERK、IRE1在正常情況下都以無活性的狀態(tài)與分子伴侶Bip結(jié)合，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時未折疊蛋白的聚集使Bip與這兩種蛋白分離[12]，本實驗結(jié)果表明，持續(xù)的高糖可上調(diào)EA.hy926內(nèi)皮細胞ERS的標志蛋白Bip，上游的感受器蛋白PERK、IRE1。PERK、IRE1都能誘導轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達，在生理狀況下，CHOP的表達量很少，主要存在于細胞質(zhì)中，而當細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，CHOP的含量大量增加并聚集在細胞核內(nèi)[13]。本實驗結(jié)果表明，HG組較Con組，ERS特異的轉(zhuǎn)錄因子CHOP mRNA表達增加，具有顯著差異，過量表達的CHOP通過激活GADD34、ERO1和死亡受體DR5等凋亡反應蛋白促進細胞凋亡,也能調(diào)節(jié)其他基因的轉(zhuǎn)錄，比如Bcl-2家族蛋白，Bcl-2家族在細胞凋亡領(lǐng)域中倍受關(guān)注，細胞對凋亡刺激的敏感性很大程度上取決于Bcl-2家族促凋亡與抗凋亡蛋白的平衡。CHOP與cAMP反應元件結(jié)合蛋白(CREP)形成二聚體能抑制Bcl-2蛋白的表達，進而促進線粒體對促凋亡因素的敏感性[14]。本實驗HG組與Con組比較，凋亡蛋白Bax表達增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低。正常血管內(nèi)皮細胞中Bax蛋白表達較低，當細胞受到損傷后Bax蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達降低，對細胞凋亡的發(fā)生和調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[15]，因此，持續(xù)的高糖可促進EA.hy926內(nèi)皮細胞凋亡，從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。

雌激素是類固醇激素家族中重要的激素，參與調(diào)節(jié)許多生理與病理效應，具有重要的心血管保護作用，主要表現(xiàn)在保護內(nèi)皮、抑制血管平滑肌細胞增殖遷移、減少動脈粥樣硬化斑塊形成和促進斑塊消退等方面[16]。Haas等[4]的研究證實，雌激素可通過對抗高糖誘導的ERS調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能，GPR30作為新近發(fā)現(xiàn)的雌激素受體，Li等[5]的研究表明，激動GPR30可抵抗高糖導致的內(nèi)皮細胞凋亡，但此作用是否通過ERS相關(guān)通路尚未見報道。本實驗以高糖誘導EA.hy926內(nèi)皮細胞ERS為模型，證實了GPR30特異性受體激動劑G1可下調(diào)高糖誘導的ERS相關(guān)蛋白Bip、PERK、IRE1以及凋亡分子Bax，CHOP mRNA，也可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。因此，GPR30特異性受體激動劑G1能對抗高糖誘導的ERS及細胞凋亡，從而拮抗動脈粥樣硬化的發(fā)生。

綜上所述，持續(xù)高糖誘導的內(nèi)皮細胞凋亡作用，部分是因為激活了ERS相關(guān)凋亡信號通路，GPR30特異性受體激動劑G1可抑制EA.hy926內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激從而發(fā)揮抗凋亡作用。

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