王逸，盧聰，宋廣青，陳怡西，武宏偉，王瓊,，曲麗娜，李瑩輝，劉新民

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；

2.瀘州醫(yī)學(xué)院，瀘州 646000；

3.中國航天員科研訓(xùn)練中心航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094)

應(yīng)激是人類所處生活環(huán)境中普遍存在的一種外界因素[1]。當(dāng)今社會(huì)，生活節(jié)奏加快、工作壓力增加，生活環(huán)境的改變，使人們暴露于應(yīng)激事件的頻率和時(shí)間都明顯增加[2]。長時(shí)間的慢性應(yīng)激導(dǎo)致的情緒障礙和認(rèn)知功能損傷，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量[3-5]。本實(shí)驗(yàn)通過行為制動(dòng)的束縛應(yīng)激方法造模，選用國內(nèi)常用的SD、Wistar大鼠為研究對(duì)象，采用不同的行為學(xué)方法評(píng)價(jià)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，以期為應(yīng)激認(rèn)知損傷動(dòng)物模型建立、機(jī)制研究以及防護(hù)藥物的研發(fā)中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系的選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

大鼠行為限制器 (北京鑫海華儀公司，中國)、大鼠水迷宮計(jì)算機(jī)監(jiān)測分析系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、中國航天員科研訓(xùn)練中心、北京三維拓盟數(shù)字影像技術(shù)有限公司)、物體識(shí)別檢測箱(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、北京鑫海華儀公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD、Wistar雄性大鼠，各12只，190 ～210 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】。實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所進(jìn)行【SYXK(京) 2008-0019】，照明系統(tǒng)人工控制12 h/12 h明暗循環(huán)(亮燈8：00-20:00，熄燈20:00-次日8:00)，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，每籠2～4只，適應(yīng)期間自由飲食飲水。本實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，隨機(jī)分為4組，Wistar、SD各2組，每組6只。分別為Wistar 28 d對(duì)照組、Wistar 28 d模型組、SD 28 d對(duì)照組、SD 28 d模型組。

1.2.2 慢性束縛應(yīng)激模型的建立

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]，將造模大鼠置于長約12～16 cm(可調(diào)節(jié))，內(nèi)徑約6 cm的聚酯透明圓柱管內(nèi)，四肢制動(dòng)，只允許頭部輕微活動(dòng)，同時(shí)行為限制器頂部有5～6個(gè)直徑1 cm左右的通氣小孔供動(dòng)物呼吸用，每天束縛10 h(22:00-次日8:00)。束縛期間各組禁食禁水，其余時(shí)間自由飲食飲水。連續(xù)束縛28 d后，進(jìn)行行為學(xué)檢測。

1.2.3 體重檢測

大鼠于分組前稱重一次。分組后，對(duì)4組動(dòng)物進(jìn)行體重的監(jiān)測和記錄，稱重均在下午進(jìn)行，每7 d稱重一次并記錄。

1.2.4 水迷宮空間記憶

水迷宮實(shí)驗(yàn)方法與文獻(xiàn)報(bào)道相似[7]。本實(shí)驗(yàn)中，圓形迷宮直徑為159 cm、高50 cm，池中水深25.5 cm左右，內(nèi)置平臺(tái)直徑 9 cm、高24 cm，水溫維持在(24±1)℃。將迷宮置于空間信息相對(duì)豐富的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，作為動(dòng)物學(xué)習(xí)過程中的空間參照物，整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)保持環(huán)境信息固定不變。將迷宮均分為4個(gè)象限，將平臺(tái)置于其中一個(gè)象限中央，作為實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物逃離水環(huán)境的唯一途徑，空間記憶階段保持平臺(tái)位置固定不變。選擇其余3個(gè)象限作為動(dòng)物的入水點(diǎn)將動(dòng)物面向池壁放入水中，每天訓(xùn)練3次，每次變換入水點(diǎn)位置(使動(dòng)物可分別從3個(gè)象限入水)，且每天所有動(dòng)物入水點(diǎn)的順序保持一致。每次訓(xùn)練前適應(yīng)10 s，使動(dòng)物獲取并學(xué)習(xí)空間環(huán)境信息。設(shè)置檢測時(shí)間為60s后，將動(dòng)物放入水中，若動(dòng)物在60 s內(nèi)找到平臺(tái)，算作尋臺(tái)成功并記錄其潛伏期，并使其在平臺(tái)上停留休息10 s。若動(dòng)物在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，結(jié)束此次訓(xùn)練并記錄潛伏期為60 s，并引導(dǎo)動(dòng)物靠近平臺(tái)使其在平臺(tái)上停留10 s。每只動(dòng)物訓(xùn)練的時(shí)間間隔為40 min。每天每只動(dòng)物3次訓(xùn)練學(xué)習(xí)的潛伏期平均值，作為評(píng)價(jià)動(dòng)物這一天學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。

經(jīng)過5d的訓(xùn)練學(xué)習(xí)后，第6天撤去平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。將動(dòng)物從原平臺(tái)象限的對(duì)角象限面向池壁放入水中，檢測其在60s內(nèi)在原平臺(tái)象限的游程比、時(shí)間比，以及穿過原平臺(tái)所在位置的次數(shù)，作為評(píng)價(jià)空間記憶能力的指標(biāo)。

1.2.5 水迷宮工作記憶

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日，開始工作記憶實(shí)驗(yàn)[8]。工作記憶歷時(shí)3d，分別將平臺(tái)置于其余3個(gè)不同象限中，每天變換平臺(tái)位置，同一天內(nèi)平臺(tái)位置保持不變。每天訓(xùn)練3次，依次從其余3個(gè)非平臺(tái)象限將動(dòng)物面朝池壁放入水中。訓(xùn)練前不予適應(yīng)，其余同空間訓(xùn)練階段一致。計(jì)算3天中，第2次訓(xùn)練潛伏期的平均值，作為評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。

1.2.6 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)[9-10]

實(shí)驗(yàn)箱為黑色聚酯塑料材質(zhì)構(gòu)成的封閉箱，體積為60 cm × 40 cm × 80 cm, 箱體左右兩側(cè)各有兩排LED燈條照明，既避免了強(qiáng)光直射對(duì)動(dòng)物行為的干擾，又可以作為計(jì)算機(jī)對(duì)動(dòng)物行為識(shí)別的背景光。頂部采用攝像頭觀察動(dòng)物的活動(dòng)情況及探索過程。實(shí)驗(yàn)過程分為3個(gè)階段：適應(yīng)期、熟悉期、測試期。適應(yīng)期為3d，每天將動(dòng)物依次放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，熟悉環(huán)境10 min。適應(yīng)期結(jié)束后，次日進(jìn)行熟悉和測試。熟悉期時(shí)，將兩個(gè)完全相同的物體放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)對(duì)稱的位置處，此兩物體距離側(cè)箱壁、箱后壁的距離均為10 cm。記錄大鼠5 min內(nèi)對(duì)兩物體的探索總時(shí)間。間隔30 min后，進(jìn)入測試期。測試期內(nèi)，將其中一個(gè)熟悉物體換為另一個(gè)大小相近但形狀和顏色不同的新穎物體，記錄大鼠對(duì)新穎物體和熟悉物體的探索時(shí)間，用辨別指數(shù)(discrimination index，DI)來評(píng)價(jià)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。辨別指數(shù)計(jì)算公式為DI=(N-F) /(N + F) ×100%，其中N(new)為新穎物體探索時(shí)間，F(xiàn)(familiar)為熟悉物體探索時(shí)間。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體重的結(jié)果

如表1所示，慢性束縛應(yīng)激(10 h/d, 28 d)能顯著抑制兩種品系大鼠體重的增加。其中，與對(duì)照組相比，Wistar模型大鼠從束縛7d開始體重顯著降低(P<0.001)。SD模型組體重的變化趨勢與Wistar相似，即與對(duì)照組相比，從第7天開始束縛應(yīng)激對(duì)SD大鼠體重的增加具有顯著抑制作用。直到束縛第28天，兩種品系大鼠體重依舊顯著低于各自對(duì)照組(P<0.001)。

表1 慢性束縛應(yīng)激對(duì)兩種品系大鼠體重的影響(n=6，± s)

2.2 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表2所示，在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，Wistar大鼠模型組與對(duì)照組在熟悉期的探索總時(shí)間沒有顯著差異；在檢測期，模型組辨別指數(shù)(DI)為負(fù)值且低于對(duì)照組，但沒有顯著差異。慢性束縛應(yīng)激對(duì)SD大鼠熟悉期的探索行為也沒有產(chǎn)生顯著影響[11]，即模型組與對(duì)照組探索總時(shí)間沒有顯著差異；而束縛應(yīng)激使SD模型大鼠檢測期的DI明顯降低，且與對(duì)照組比差異性有顯著(P<0.05)。

表2 慢性束縛應(yīng)激對(duì)兩種品系大鼠新物體識(shí)實(shí)驗(yàn)的影響(n=6，± s)

2.3 水迷宮空間學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

慢性束縛28d后的空間學(xué)習(xí)能力檢測表明，Wistar模型組學(xué)習(xí)記憶能力改變不明顯，其潛伏期與對(duì)照組比較差異無顯著性(圖1a)。同時(shí)由圖1可以看出，SD模型組大鼠的潛伏期與對(duì)照組比，出現(xiàn)穩(wěn)定性的增加，在空間學(xué)習(xí)最后一天(第5天)束縛組的潛伏期與對(duì)照組比差異有顯著性(P<0.05)。而兩種品系大鼠水迷宮空間學(xué)習(xí)階段的游泳速度與各自模型組比差異無顯著性(圖1 b)。

注：a.對(duì)潛伏期的影響，b.對(duì)游泳速度的影響。*表示與對(duì)照組比P<0.05(n=6，± s)。

2.4 水迷宮工作記憶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在工作記憶檢測中，計(jì)算第2次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為評(píng)價(jià)工作記憶能力指標(biāo)[8,12]。由圖2 a可知，每天束縛10 h，束縛28 d后，SD模型組尋臺(tái)時(shí)間延長，潛伏期增加，與其相應(yīng)對(duì)照組比差異有顯著性(P<0.05)。而束縛應(yīng)激對(duì)Wistar大鼠工作記憶能力影響不顯著。由圖2b 可知，工作記憶階段，束縛應(yīng)激對(duì)Wistar、SD兩種大鼠游泳速度的影響不顯著。

注：a.對(duì)潛伏期的影響，b.對(duì)游泳速度的影響。*表示與對(duì)照組比P<0.05(n=6，± s)。

3 討論

SD和Wistar均屬于遠(yuǎn)交系封閉群白色大鼠，是國際和國內(nèi)臨床前實(shí)驗(yàn)研究、學(xué)習(xí)記憶損傷機(jī)制研究以及相關(guān)防護(hù)藥物篩選中常用的動(dòng)物品系。束縛，是將動(dòng)物置于無法逃脫的應(yīng)激環(huán)境中，通過行為制動(dòng)的方式，模擬人類社會(huì)中無法避免的擁擠、壓力性空間等應(yīng)激因素，造成動(dòng)物心理應(yīng)激的一種常用的造模方法。慢性束縛，是持續(xù)時(shí)間較長的一種造模方式，一般造模時(shí)間大于1 d[13]。更好的模擬了現(xiàn)代社會(huì)中，人們面臨的壓力持續(xù)時(shí)間增加的情況。本實(shí)驗(yàn)首次通過兩種不同的認(rèn)知行為學(xué)評(píng)價(jià)方法考察束縛應(yīng)激對(duì)這兩品系大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)是考察動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的一種常用方法[8]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明慢性束縛應(yīng)激(10 h, 28 d)對(duì)SD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的損傷更明顯(見圖1)。這與兩品系大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中海馬區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量及功能有關(guān)。應(yīng)激特征性地對(duì)HPA軸(下丘腦-垂體-腎上腺軸)的激活，最終會(huì)導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素(大鼠主要為皮質(zhì)酮，人主要為皮質(zhì)醇)分泌的增加[14]。糖皮質(zhì)激素在中樞系統(tǒng)中，主要通過海馬神經(jīng)元中豐富的糖皮質(zhì)激素受體，影響與海馬密切相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶[15-16]。而SD大鼠較Wistar大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)含量更為豐富的錐體神經(jīng)元細(xì)胞[17]，可能是應(yīng)激引起SD大鼠神經(jīng)元損傷強(qiáng)度和波及范圍較廣，進(jìn)而導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)更為明顯的損傷的重要原因。

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)動(dòng)物識(shí)別記憶的簡單、靈敏的方法[10]。本研究中，兩品系模型大鼠在熟悉期表現(xiàn)出與各自對(duì)照組相同的探索能力，但是檢測期的辨別指數(shù)與對(duì)照組比出現(xiàn)差異。這排除了探索行為的改變對(duì)認(rèn)知檢測結(jié)果的干擾，同時(shí)表明束縛應(yīng)激對(duì)大鼠的識(shí)別記憶能力產(chǎn)生損傷，且對(duì)SD大鼠的損傷更明顯(見表2)。

水迷宮工作記憶實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，慢性束縛應(yīng)激對(duì)SD大鼠的非空間學(xué)習(xí)記憶能力的損傷較Wistar大鼠更明顯(見圖2)。

結(jié)果表明，慢性束縛應(yīng)激引起的外周作用在兩品系大鼠中表現(xiàn)一致[18]。兩種檢測方法中，水迷宮對(duì)動(dòng)物的體力要求較高，其具體體現(xiàn)在游泳速度上。而圖1，2表明束縛應(yīng)激在對(duì)速度的影響不顯著的情況下，可引起空間學(xué)習(xí)能力、工作記憶的損傷。進(jìn)而表明體重下降只是應(yīng)激引起的外周作用的一種表現(xiàn)，與學(xué)習(xí)記憶能力并沒有一定的相關(guān)性。

在慢性束縛應(yīng)激模型建立過程中，根據(jù)所用束縛器的形狀、規(guī)格不同，主要有以下的束縛方式[19]：(1)將動(dòng)物置于圓形或錐形透明樹脂束縛器內(nèi)；(2)將動(dòng)物固定于平板或襯墊上；(3)將動(dòng)物裹在毛巾中；(4)將動(dòng)物置于金屬鐵絲束縛器中，等。本研究所用方式在不影響動(dòng)物生理代謝的情況下，盡量避免了對(duì)動(dòng)物的物理性傷害，產(chǎn)生單純由壓力性空間所導(dǎo)致的心理應(yīng)激模型。符合動(dòng)物倫理的要求，同時(shí)滿足了心理應(yīng)激的造模條件。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)通過2種行為學(xué)方法(物體認(rèn)知、水迷宮)中的3種模式(新物體識(shí)別模式、空間記憶模式、工作記憶模式)，分別考察了所采用的慢性束縛應(yīng)激(10 h，28 d)造模方式對(duì)Wistar、SD兩品系大鼠空間、非空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。3種模式的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明本研究采用的束縛應(yīng)激方式可對(duì)大鼠認(rèn)知能力產(chǎn)生損傷，且SD大鼠的損傷更明顯。因此，本方法可作為束縛應(yīng)激造模的一種方法，用以研究心理應(yīng)激對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響。且本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在束縛應(yīng)激所致認(rèn)知損傷機(jī)制研究以及防護(hù)藥物的篩選中，選用SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物更為適宜。

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