呂俊，高家林，王李卓

（皖南醫(yī)學院生物化學教研室，皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院內分泌科，安徽 蕪湖 241002 E－mail：2802654657＠qq.com）

遺傳學是指基于基因序列改變所致基因表達水平變化，如基因突變、基因雜合丟失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定等；而表觀遺傳學則是指基于非基因序列改變所致基因表達水平變化，如DNA甲基化和染色質構象變化等。表觀遺傳學（epigenetics）這一概念最早在1942年由康拉德·哈爾·沃丁頓提出，認為基因型通過一些偶然的、不確定的機制決定了不同的表型，并指出表觀遺傳與遺傳是相對的。主要研究基因型和表型的關系。幾十年后，霍利迪對這個內容作了補充和完善。即表觀遺傳學是基因的DNA序列不發(fā)生改變的前提下，基因的表達水平和功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可以遺傳的表型。主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、微小RNA干擾等。其與腫瘤、糖尿病、心血管、代謝綜合征等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關。

糖尿病是世界第三大慢性疾病，嚴重危害著人類健康。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人均壽命的延長，我國糖尿病的患病率正在急劇增高，預計到2025年，我國糖尿病患者總數(shù)可能達到1億人左右。糖尿病腎病是糖尿病的嚴重并發(fā)癥。其發(fā)生率可達20%～50%之多。糖尿病腎病是糖尿病患者高死亡率的重要原因之一［1］。值得注意的是糖毒作用后即使血糖控制在正常范圍，糖尿病腎臟的病變依然持續(xù)進展，而早期強化血糖控制則可產(chǎn)生持久的效益，這一現(xiàn)象被稱為“代謝記憶”［2］或者“遺留效應”［3］。

正常情況下，腎小球細胞外基質（ECM）的合成及降解與腎小球毛細血管叢的再生及修復保持一種高度協(xié)調，它受各種細胞因子、蛋白酶及抑制因子的調控，是一個復雜的過程。任何一個環(huán)節(jié)的細微變化均可導致腎小球中ECM的合成與降解失衡從而出現(xiàn)腎小球基質膜的破壞和ECM的堆積，導致腎小球的硬化。腎小球硬化是腎小球損傷的結局，而高血糖無疑是上述病變形成的始動因素之一。糖尿病腎病相關基因的發(fā)現(xiàn)及其功能的闡明將為糖尿病腎病的早期診斷、基因治療提供有效的手段。即使血糖控制在理想狀態(tài)下，其炎癥仍能持續(xù)發(fā)生，間質化繼續(xù)加重。提示存在“代謝記憶”，有研究指出可從表觀遺傳學水平闡明其發(fā)病機制。

1 DNA甲基化、去甲基化

1.1 DNA甲基化 是目前研究最為深入的表觀遺傳學機制之一［4］，它是指S－腺苷甲硫氨酸（SAM）脫去1個甲基轉變?yōu)镾－腺苷同型半胱氨酸（SAH），同時將該甲基轉運至胞嘧啶－鳥嘧啶（CpG）二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子（c）上，修飾為5－甲基胞嘧啶（5－mC）。CpG二核苷酸在基因組中出現(xiàn)的頻率較低，但在特定區(qū)域，如基因啟動子區(qū)，CpG二核苷酸密集存在，可高達60%～70%，發(fā)揮調控基因轉錄作用。DNA甲基化需在DNA甲基轉移酶的催化下進行。

DNA發(fā)生甲基化后，可以通過以下三個方面直接或者間接影響該基因的表達［5］：①通過阻斷轉錄起始因子與啟動子的結合直接抑制基因轉錄；②可招募甲基化CpG結合蛋白（methyl－CpG－binding proteins，MBPs），其與5－甲基胞嘧啶結合后，將進一步阻礙轉錄起始因子與啟動子結合；③還可招募組蛋白去乙?；感纬蓮秃衔?，使組蛋白去乙?；?，導致染色質聚縮成非活性致密結構，間接抑制基因轉錄，參與x染色體沉默、基因印跡、組織特異性基因表達等生理過程。

1.2 DNA去甲基化 是5－甲基胞嘧啶經(jīng)過一系列反應被胞嘧啶所取代的過程。長期以來，一直認為去甲基化主要發(fā)生在DNA復制過程中，是一個被動的過程，然而目前，有關DNA主動去甲基化的機制被提出［6］。

2 組蛋白修飾

組蛋白修飾是表觀遺傳學中的另外一項重要的內容。組蛋白是真核生物染色體的基本結構蛋白，是一類小分子堿性蛋白質［7］。在真核生物體內，DNA以環(huán)狀超螺旋形式圍繞在4種核心組蛋白（H2A、H2B、H3、H4）周圍組成核小體，是染色質的基本單位。組蛋白H1結合于核小體間的連接DNA（1inker DNA）上，使核小體成串排列，形成串珠樣結構。組蛋白有兩個活性末端：即羧基端和氨基端。

核心組蛋白的N末端在物種之間十分保守且易發(fā)生各種類型轉錄后修飾，這種常見的組蛋白外在修飾作用包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、羰基化等，它們都是組蛋白密碼的基本元素。該結構不僅利于壓縮和保護DNA，而且可以保存遺傳信息和控制基因表達［8］。修飾后的殘基通過兩種途徑影響基因的功能，一是通過改變構像或者改變組蛋白電荷而影響核小體－核小體或DNA－核小體相互作用。從而改變染色質的疏松或者凝集狀態(tài)；二是形成靶點，招募特定蛋白質影響轉錄過程。

2.1 組蛋白甲基化 主要發(fā)生在賴氨酸和精氨酸側鏈的氮原子上，其中賴氨酸的甲基化被認為是具有穩(wěn)定性和遺傳性。由甲基轉移酶和去甲基酶催化完成。甲基轉移酶主要有三個蛋白家族：蛋白質精氨酸甲基轉移酶家族、SET家族和非SET家族［9］。組蛋白賴氨酸甲基化主要發(fā)生在H3和H4上。組蛋白精氨酸的甲基化和基因的激活密切相關［10－11］。而 H3、H4精氨酸的去甲基化則可能導致基因沉默。甲基轉移酶和去甲基轉移酶可以逆轉調節(jié)組蛋白的甲基化過程，對基因的表達起著決定性的作用［12］。譬如：轉甲基酶set7／9可能與RNA聚合酶II相互作用共同調節(jié)胰島β細胞的基因表達；賴氨酸4和賴氨酸36發(fā)生的組蛋白H3甲基化，常使常染色質結構疏松伴隨轉錄能力的增強，但是賴氨酸9和27發(fā)生的組蛋白H3的甲基化則使染色體的結構致密，并伴隨有基因的沉默［13］。

2.2 組蛋白的乙?；?組蛋白的乙?；饕l(fā)生在H3和H4的N端的賴氨酸位點上，主要由乙酰轉移酶和去乙酰轉移酶協(xié)調進行。乙酰轉移酶可以使組蛋白賴氨酸的相關位點乙?；瘻p弱組蛋白和DNA結合的能力，促進轉錄。去乙?；缚梢允菇M蛋白去乙酰化增強組蛋白與DNA結合能力，抑制轉錄。譬如賴氨酸殘基的乙?；彩悄壳傲私獾谋容^清楚的一個過程［14］，乙?；蟮腄NA結構變得松散使轉錄因子易于結合上去，這一過程往往伴隨DNA的轉錄活化［15］，這一修飾過程同時又可以被組蛋白去乙酰化酶所逆轉。這些修飾作用由修飾位點和修飾程度所決定，或互相協(xié)同或互相拮抗，動態(tài)調節(jié)基因表達。

3 糖尿病腎病與表觀遺傳修飾

無論1型還是2型糖尿病都可顯著加速微血管的病變從而引發(fā)并發(fā)癥如糖尿病腎病。涉及其中的主要事件包括免疫調控炎癥因子的表達，糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的生成，多元醇和氨基己糖代謝途徑及PKC信號轉導通路的激活等［16－17］。Wren等［18］通過 Data－Mining分析羅列了引起糖尿病及其并發(fā)癥的諸多因素，結果發(fā)現(xiàn)“甲基化”和“染色質”的統(tǒng)計得分最高，表明機體的表觀遺傳修飾是糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要原因。

3.1 DNA甲基化與糖尿病腎病 表觀遺傳因素在基因和環(huán)境之間起到調節(jié)作用，并影響糖尿病及其并發(fā)癥。Bell等［19］測定了兩組高加索人外周血甲基化水平（分別為糖尿病組和正常組），發(fā)現(xiàn)兩組的DNA甲基化水平有著明顯的差異。也有研究表明DNA甲基化修飾可能是糖尿病的早期事件。最新研究對唾液中提取的DNA基因進行甲基化水平測定，發(fā)現(xiàn)糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）不同的發(fā)展階段 DNA 的甲基化差異顯著，根據(jù)DN的發(fā)展階段分成兩組，一組是糖尿病終末期腎病與另外一組是無腎臟并發(fā)癥的糖尿病患者組。發(fā)現(xiàn)此兩組至少有兩個CpG位點的甲基化存在著明顯的差異［20］。有學者進一步指出糖尿病大鼠腎組織內CpG二核苷酸C堿基處的DNA甲基化模式發(fā)生改變，并伴隨DNA甲基化酶、RNA聚合酶的活性下降。并且通過高通量分析DNA甲基化確定了至少19個CpG位點與DN的發(fā)生密切相關，但在1型糖尿病患者中，糖尿病相關基因UNC13B則出現(xiàn)了DNA的高甲基化。這說明DNA的甲基化在DN中的作用機制以及作用模式比較復雜。在新近的一項臨床試驗中發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血清白細胞介素17（interleukin－17，IL－17）、白細胞介素6（interleukin－6，IL－6）、超敏CRP（hypersensitive C－ractive protein，hsCRP）等炎癥因子明顯高于健康組（P＜0.05），且糖尿病腎病組顯著高于單純糖尿病組（P＜0.05）［21］。從表觀遺傳學領域探索機制，采用甲基化特異性PCR技術（Methyl－specific PCR，MSP）檢測大鼠主動脈各炎癥因子基因啟動子區(qū)的甲基化水平，結果顯示糖尿病組IL－17、IL－6、腫瘤壞死因子α（TNF－α）等基因啟動子區(qū)的DNA甲基化水平顯著低于正常組，并與mRNA和蛋白的表達水平成負相關。上述研究提示高糖誘導基因組DNA甲基化水平改變致炎性基因高表達可能是糖尿病腎病病變一個潛在原因［18］。

3.2 組蛋白修飾與糖尿病腎病 組蛋白修飾是表觀遺傳學中的另一項重要的內容。其在糖尿病腎病的發(fā)病過程中也扮演著重要的角色。目前對于糖尿病腎病的發(fā)病機制存在一個共識，即DN患者的腎臟血管發(fā)生了炎癥改變。與單純的糖尿病人相比，炎癥因子均有不同程度的升高。NF－ΚB是DN炎癥通路的重要因子之一。當機體處于高糖狀態(tài)或者血糖控制不佳時，NF－ΚB的含量明顯升高［17］。繼而可以募集炎癥細胞在腎臟血管壁聚集并活化下游的炎癥因子，從而造成腎臟的血管炎性損傷，繼而出現(xiàn)臨床癥狀。Sayyed等［22］將暴露于高糖環(huán)境的牛主動脈內皮細胞的染色質免疫提純，發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉移酶Set7富集于NF－KB p65基因的啟動子區(qū)激活轉錄，當小干擾RNA（small interferingRNA，siRNA）使Set7沉默或敲除時，高糖無法誘導NF－KB p65基因的高表達［23］。Set7為特異性的單甲基化酶靶向作用于組蛋白賴氨酸4（H3K4）［24］，表明高糖致NF－KB表達增加可能是通過Set7催化H3K4ml實現(xiàn)的。

腎臟細胞外基質過度蓄積和腎小管上皮－間質轉型將導致腎臟纖維化，而腎臟纖維化和DN發(fā)病密切相關。組蛋白去乙酰酶決定了組蛋白乙酰化狀態(tài)，從而調節(jié)基因的表達。實驗證明，組蛋白去乙酰酶－2的活性在糖尿病模型大鼠中明顯增強。并且還發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙酰酶抑制劑能明顯減少細胞外基質的mRNA和蛋白的表達，并能防止腎小管上皮細胞上皮－間質轉型。同時在正常大鼠的腎小管上皮細胞中用RNA干擾的方法是組蛋白去乙酰酶－2基因沉默后纖維連接蛋白的mRNA的表達水平有所減少［25］。

4 結語

近年來，表觀遺傳學對糖尿病腎病的具體作用機制還有待于進一步研究，但是已日益受到中外學者的重視，而且有可能成為未來治療策略的理論基礎。從理論上講表觀遺傳學不僅可以揭示糖尿病腎病的發(fā)病機制，而且表觀遺傳藥物具有比傳統(tǒng)藥物更高的治療潛力和較低的不良反應?，F(xiàn)在各種表觀遺傳藥物，如DNA甲基化抑制劑等正在不同程度的研究中。我們相信在征服糖尿病腎病的道路上，表觀遺傳學將成為最有利最可靠的工具之一。

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