張 昊 王 勇

（大理學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，大理671000）

Nestin屬于中間絲蛋白家族，是一種由胚胎期神經(jīng)前體細(xì)胞一過(guò)性表達(dá)的Ⅵ型中間絲蛋白，目前作為神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性標(biāo)記物?，F(xiàn)就Nestin的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 Nestin的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

1．1 發(fā)現(xiàn)

1985年，Hockfield與Mckay首先發(fā)現(xiàn)，在胚胎大鼠脊髓神經(jīng)管神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的一種蛋白，被nestin抗體特異性識(shí)別。因?yàn)榭贵w識(shí)別的細(xì)胞具有神經(jīng)前體細(xì)胞的特征，所以nestin陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是神經(jīng)前體細(xì)胞［1］。1990 年 Lendahl［2］等克隆出編碼nestin基因，在該基因編碼的蛋白中發(fā)現(xiàn)，其中間段-α螺旋桿結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與已知的其它所有5類中間絲蛋白有16%～29%的相似性，而被歸為中間絲蛋白。通過(guò)基因氨基酸序列分析表明，它與其他幾種中間絲蛋白有明顯不同，將其單獨(dú)歸為第Ⅵ類中間絲蛋白，并將其命名為Nestin（巢蛋白）。

1．2 結(jié)構(gòu)

1992年Dahlstrand［3］等最早分離了人類的巢蛋白基因，通過(guò)檢測(cè)和比較發(fā)現(xiàn)，人和大鼠巢蛋白基因在羧基端重復(fù)區(qū)域和內(nèi)含子的位置保守性較高，并且在3個(gè)內(nèi)含子中的兩個(gè)是與神經(jīng)絲共享的，充分表明nestin在從其他中間絲分離出來(lái)之后和神經(jīng)絲來(lái)自同一祖先的可能，而且也是神經(jīng)絲分支中分離出的最早一員。

Nestin的結(jié)構(gòu)與其他中間絲蛋白很相似，其氨基酸殘基數(shù)為1821，蛋白質(zhì)分子量為240，000。含有一個(gè)307個(gè)氨基酸的保守核心區(qū)，其中有一個(gè)α螺旋是由7個(gè)氨基酸特征序列構(gòu)成的，殘基a和d處于疏水；這個(gè)特征序列被認(rèn)為具有促進(jìn)絲形成時(shí)卷曲螺旋的相互作用，同時(shí)7個(gè)氨基酸特征序列由保守性不強(qiáng)的間隔序列分開［4］。作為第Ⅵ類中間絲蛋白，與其它5類中間絲蛋白的相比較，其基因的內(nèi)含子位置，蛋白的N端（頭，較短，只有11個(gè)氨基酸）、C端（尾，較長(zhǎng)，有479個(gè)氨基酸，且含有許多電荷密度高的氨基酸重復(fù)序列）以及在組織細(xì)胞內(nèi)的分布等方面均有區(qū)別。

2 Nestin的生物學(xué)活性

2．1 Nestin的表達(dá)

Nestin在細(xì)胞內(nèi)位于細(xì)胞質(zhì)，主要在未分化，具有分裂能力的細(xì)胞中表達(dá)，且具有嚴(yán)格的時(shí)空順序，其表達(dá)與其它中間絲成員的表達(dá)有密切關(guān)系。例如，在CNS發(fā)育中，當(dāng)神經(jīng)胚形成時(shí)，Nestin開始在神經(jīng)板皮層細(xì)胞表達(dá)，神經(jīng)細(xì)胞遷移基本完成后，Nestin的表達(dá)量下降，vimentin開始表達(dá)，隨后兩者共存。一旦神經(jīng)前體細(xì)胞朝終末方向分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞（如星形膠質(zhì)細(xì)胞）時(shí)，Nestin就停止表達(dá)，被α-internexin、神經(jīng)絲或外周蛋白代替［5］。這種表達(dá)模式在骨骼肌和心肌發(fā)育中得以進(jìn)一步的證實(shí)。巢蛋白在骨骼肌母細(xì)胞和心肌細(xì)胞中最先高表達(dá)，出生后表達(dá)明顯降低。隨后是vimentin和結(jié)蛋白表達(dá)，三方共存于骨骼肌母細(xì)胞和心肌細(xì)胞［6］?？梢?，Nestin的表達(dá)有著嚴(yán)格的時(shí)空順序，保證了神經(jīng)前體細(xì)胞執(zhí)行其內(nèi)在的功能，與朝終末方向分化成相應(yīng)的成熟細(xì)胞相匹配。

近年來(lái)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在成年大鼠和成人基底前腦隔-斜角帶復(fù)合體和海馬可見許多nestinir神經(jīng)元．這些nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和神經(jīng)元核蛋白（NeuN），但不與膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）共存，提示這些nestin陽(yáng)性細(xì)胞為成熟的神經(jīng)元，從而推論這是一類較恒定的神經(jīng)元。雙標(biāo)染色結(jié)果顯示，nestin-ir神經(jīng)元與輔酶Ⅱ依賴性黃遞酶神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元相間分布，但不呈交叉反應(yīng)，因此認(rèn)為，nestin-ir神經(jīng)元可能是MSDB中區(qū)別于膽堿能、GABA能神經(jīng)元的新神經(jīng)元，是與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的第3類神經(jīng)元［7］。通過(guò)Nestin免疫熒光與EdU熒光雙標(biāo)觀察及Nestin與DCX常規(guī)免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示基底前腦的nestin陽(yáng)性神經(jīng)元不表達(dá)DCX，從而證實(shí)不是新生的神經(jīng)元，而是一種成熟的神經(jīng)元［8］。通過(guò)單細(xì)胞RT-PCR、免疫熒光及電生理研究證實(shí)，基底前腦的nestin陽(yáng)性細(xì)胞是膽堿能神經(jīng)元的一種亞型［9，10］，而不是別于膽堿能神經(jīng)元的新神經(jīng)元。以上表明，基底前腦巢蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元是成熟膽堿能神經(jīng)元的一種功能狀態(tài)，而不是一種新生的神元。推測(cè)可能是Nestin讓膽堿能神經(jīng)元被賦予了特殊的功能，使神經(jīng)元具備了更強(qiáng)的生理活性和可塑性。

2．2 Nestin表達(dá)的基因調(diào)控

Nestin轉(zhuǎn)基因研究揭示，巢蛋白基因內(nèi)有3個(gè)內(nèi)含子，其中第1和第2內(nèi)含子中分別有一個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞型特異調(diào)節(jié)因子，分別指導(dǎo)報(bào)告基因在發(fā)育中的肌肉細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)。Nestin基因在第1個(gè)內(nèi)含子內(nèi)有兩個(gè)E-盒模體（E-box motif），表現(xiàn)為螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix）結(jié)構(gòu)，有調(diào)控骨骼肌母細(xì)胞表達(dá)巢蛋白的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。第2個(gè)內(nèi)含子中決定巢蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的結(jié)構(gòu)元件就存在于3′端保守區(qū)［11］。研究證實(shí)，Nestin基因的第2個(gè)內(nèi)含子具有決定Nestin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的兩個(gè)增強(qiáng)子，分別為CNS增強(qiáng)子和區(qū)域特異性增強(qiáng)子［12］。在該增強(qiáng)子中，有一段長(zhǎng)達(dá)30個(gè)堿基的結(jié)構(gòu)域（Nes30），包含有核激素受體，轉(zhuǎn)錄因子SOX和轉(zhuǎn)錄因子POU的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)揮核心控件的特性［13］。在Nestin的第2個(gè)內(nèi)含子中POU轉(zhuǎn)錄因子和位于POU轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上游的轉(zhuǎn)錄因子SOX的協(xié)同作用對(duì)增強(qiáng)子的激活起著關(guān)鍵性作用，這說(shuō)明在Nes30中，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用在很大程度上反應(yīng)了對(duì)巢蛋白神經(jīng)增強(qiáng)子的調(diào)控。此外，Nestin的表達(dá)還受細(xì)胞周期蛋白素依賴性激酶（Cdk5）和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子等內(nèi)部因素調(diào)控，表明巢蛋白是上述因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用的一個(gè)重要的靶基因［14］。而外部因素，如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族、腦源性生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞抑制因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素3、血小板源性生長(zhǎng)因子等也對(duì)Nestin表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。

2．3 Nestin的功能

目前Nestin的功能并不是十分清楚，近幾年，由于基因工程技術(shù)的發(fā)展，研究者通過(guò)轉(zhuǎn)基因以及基因敲除等手段研究Nestin的功能成為可能，并已取得了一些成果。

Nestin作為一種中間絲蛋白，可以和微管、微絲一起構(gòu)成細(xì)胞骨架而達(dá)到維持神經(jīng)前體細(xì)胞的正常形態(tài)，含有Nestin的細(xì)胞骨架有可能增加神經(jīng)細(xì)胞的伸縮性和彈性，這對(duì)于發(fā)育過(guò)程是必要的。體外中間絲組裝及轉(zhuǎn)基因研究表明，由于Nestin不能獨(dú)立、自行組裝成中間絲，必須依賴與其共存的vimentin或α-internexin共聚組裝成神經(jīng)前體細(xì)胞內(nèi)的中間絲，才能發(fā)揮細(xì)胞骨架的作用。

在胚胎期具有分裂能力的心肌細(xì)胞及骨骼肌母細(xì)胞所表達(dá)的巢蛋白，也可能以共聚的組裝方式與波形蛋白（vimentin）、結(jié)蛋白（desmin）一道形成中間絲發(fā)揮相應(yīng)的作用［15］。Nestin蛋白作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志，也是神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新所需［16］，因此Nestin可用于神經(jīng)干細(xì)胞的分離、鑒別、培養(yǎng)，跟蹤巢蛋白的表達(dá)來(lái)分析神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生過(guò)程。

3 展望

近年來(lái)研究證明，在胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌等上皮腫瘤中也存在Nestin的表達(dá)［17］，大部分人認(rèn)為檢測(cè)Nestin在腫瘤組織中的表達(dá)水平對(duì)于評(píng)價(jià)腫瘤的生物學(xué)行為和患者的預(yù)后有明顯幫助。這充分證明Nestin在腫瘤細(xì)胞及反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，可被作為前體細(xì)胞的標(biāo)志物或診斷低分化腫瘤的指標(biāo)；也可作為神經(jīng)系統(tǒng)病變和損傷的快速敏感診斷指標(biāo)之一。醫(yī)務(wù)工作者可以使用巢蛋白的熒光組化方法，通過(guò)檢測(cè)巢蛋白的表達(dá)情況，從而確定病變發(fā)生的部位。因此臨床上巢蛋白可作為疾病的診斷指標(biāo)。

Nestin作為中間纖維蛋白的第4個(gè)亞族，被眾多研究者當(dāng)作是神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的標(biāo)志物［18］，因此可用于分離神經(jīng)干細(xì)胞，通過(guò)跟蹤巢蛋白的表達(dá)來(lái)分析神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生過(guò)程。實(shí)驗(yàn)表明，神經(jīng)干細(xì)胞移植到阿爾茨海默病（Alzheimer）模型大鼠腦內(nèi)，不僅能夠存活、增殖，并且可替代丟失、受損或壞死的神經(jīng)細(xì)胞而重建神經(jīng)通路，修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)，從而改善學(xué)習(xí)記憶能力［19］。這表明，神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)治療如阿爾茨海默病（老年性癡呆）、帕金森病、外傷性脊髓損傷等中樞神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了一種有利的新手段，從而解決了胚胎腦組織移植治療這些疾病中所遇到的眾多技術(shù)和倫理道德難題［20］。因此，如何通過(guò)Nestin的研究，有效激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，使其成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有效治療手段的研究成為當(dāng)今的熱點(diǎn)。隨著對(duì)Nestin表達(dá)的調(diào)控機(jī)制的深入研究，Nestin在臨床應(yīng)用中越來(lái)越廣泛，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新思路。

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