陳韶萍， 黃 振， 郭瓊霞*， 劉長明

1福建出入境檢驗檢疫局,福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州 350001 2福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建 福州 350002

實蠅類害蟲隸屬雙翅目Diptera實蠅科Tephritidae，約有500屬4500種，除了南極與北極這2個高緯度區(qū)域，實蠅在全世界的熱帶、亞熱帶以及溫帶地區(qū)均有分布(梁廣勤等，2008；王振華等，2009)。世界上具有重要經(jīng)濟意義的實蠅主要分為5個類群，即按實蠅屬Anastrepha、果實蠅屬Bactrocera、寡鬃實蠅屬Dacus、臘實蠅屬Ceratitis以及繞實蠅屬Rhagoletis(黃振和黃可輝，2012; 梁廣勤等，2008)。我國有實蠅400余種，絕大多數(shù)種類為水果、蔬菜和花卉作物的害蟲，約有15屬22亞屬150余種，其中70余種被認為是具有危險性或潛在危險性的重要害蟲(黃振，2010)；同時其危害的寄主范圍廣，在進境口岸經(jīng)常被截獲(黃振等，2012、2014)。

長期以來，實蠅類害蟲的口岸檢疫鑒定主要以完整的成蟲外部形態(tài)特征為依據(jù)。然而，在口岸中經(jīng)常截獲的大多是實蠅幼蟲，在這種情況下，通常是將幼蟲在室內(nèi)飼養(yǎng)為成蟲再進行鑒定，因其需要花費較長的時間，從而影響果蔬進出口貿(mào)易的通關速度。近年來，隨著分子生物學的快速發(fā)展，越來越多的分子生物學技術被用于昆蟲分類鑒定，如同工酶技術、DNA條形碼技術、PCR技術、隨機擴增多態(tài)性DNA技術(RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性技術(RFLP)、擴增片段長度多態(tài)性技術(AFLP)、基因芯片技術等。這給實蠅分類鑒定帶來了契機，即在傳統(tǒng)分類的基礎上借助分子手段，可以更好地解決實蠅物種鑒定問題。本文主要對目前已經(jīng)被用于實蠅鑒定的分子生物學技術的優(yōu)缺點及其國內(nèi)外研究進展進行綜述，以期為今后選用分子生物學技術鑒定實蠅種屬提供參考。

1 DNA條形碼技術

1. 1 原理及特點

2003年，加拿大動物學家Paul Hebert博士提出了DNA條形碼(DNA barcoding)的概念。DNA條形碼技術的原理類似于商品條形碼，關鍵是對物種的某一段標準目的基因片段進行大范圍比對分析，進而識別、鑒定未知的物種或者發(fā)現(xiàn)新種及隱存種等(Hebertetal.，2003)。近年來，由于DNA條形碼技術操作快速簡便、結果準確性高以及可進行非專家物種鑒定等特點，為生物分類學提供了信息化的分類標準和有效的分類手段，成為目前發(fā)展速度最快的前沿學科之一。

目前，被選作標記的分子基因很多，但僅COⅠ (cytochrome oxidase Ⅰ或coxⅠ) 基因被選為DNA條形碼的靶標基因。COⅠ基因是位于線粒體呼吸鏈上的編碼細胞色素氧化酶亞基Ⅰ的基因，該基因具有幾個特點(Lin & Danforth,2004)：(1)大部分為母系遺傳，相對保守且沒有內(nèi)含子，不包含重復序列；(2)與其他基因相比，進化速率較快；(3)AT含量較高，且在細胞內(nèi)為多拷貝，比較容易被擴增。此外，COⅠ基因有足夠的變異能夠將不同物種區(qū)分開。

1. 2 國內(nèi)外研究進展

李志紅等(2011)利用DNA條形碼技術成功鑒定了采自泰國四色菊市番石榴爛果中的番石榴實蠅Bactroceracorrecta(Bezzi)幼蟲。Abd-El-Samie & El Fiky (2011)基于COⅠ序列，分析闡述了在埃及各地區(qū)建立種群的桃實蠅Bactrocerazonata(Saunders)的系統(tǒng)發(fā)育關系。姜帆等(2011)利用DNA條形碼技術和BOLD系統(tǒng)，對廣西南寧地區(qū)苦瓜中的實蠅幼蟲樣品進行了序列測定、比對和分析。Liangetal.(2011)利用試驗獲得的25種實蠅的155條COⅠ序列，通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹與遺傳距離分析，證實了COⅠ條形碼序列能準確鑒定、識別除橘小實蠅Bactroceradorsails(Hendel)復合種外的中國果實蠅種屬。Liuetal.(2011)基于形態(tài)學及COⅠ條形碼序列，成功鑒定了來自布隆迪的入侵果實蠅BactrocerainvadensDrew。劉慎思等(2012)利用DNA條形碼技術構建實蠅類害蟲快速鑒定技術體系，并證實該物種識別技術可用于口岸截獲的實蠅類害蟲幼體及殘體的準確鑒定。Jiangetal.(2013)利用DNA條形碼技術，基于SNP位點設計了能夠準確鑒定、識別番石榴實蠅的特異性引物。

1. 3 實蠅DNA條形碼的應用情況

根據(jù)BOLD Systems現(xiàn)有的數(shù)據(jù)，總結了截至2014年10月22日實蠅DNA條形碼的種類、已公布的記錄數(shù)及其涉及的實蠅種類(表1)。由表1可以看出，實蠅DNA條形碼的種類主要有COⅠ-5P、COⅠ-3P、COⅡ、COⅢ、CYTB、atp6、28S等7種。其中以COⅠ標記為主，已公布的記錄數(shù)為4540，是其他5種DNA標記的113. 5倍，其中又以COⅠ-5P標記為主，研究的實蠅種類達315種，COⅠ-3P標記的有116種；果實蠅屬被研究公布的記錄數(shù)最多，其次為臘實蠅屬和寡鬃實蠅屬；BOLD Systems數(shù)據(jù)庫目前以COⅠ-5P標記的果實蠅屬種類達61種，寡鬃實蠅屬達70種，臘實蠅屬55種，按實蠅屬11種，繞實蠅屬12種。

2 以PCR(polymerase chain reaction)為基礎特異性擴增快速鑒定技術

2. 1 常規(guī)PCR技術

2. 1. 1 原理及特點 PCR，即聚合酶鏈式反應，由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年建立，是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的技術，其反應體系主要包括DNA靶序列、引物、4種dNTP、DNA聚合酶以及適合的緩沖液體系，由高溫變性、低溫退火、適溫延伸3步為一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA序列得以擴增(王廷華等，2005)。該技術操作快速簡便、特異性強及靈敏度高，但是具有易被污染、易出現(xiàn)假陽性和假陰性等缺點。

2. 1. 2 國內(nèi)外研究進展 余道堅等(2004)利用mtDNA COⅠ部分序列，通過對大量的實蠅基因序列進行分析比較，設計出2對特異性引物，應用定性PCR技術成功檢測、鑒定了番石榴實蠅。崔俊霞等(2006)采用形態(tài)學觀察與PCR技術相結合的方法，成功鑒定了從臺灣水果中截獲的疑似橘小實蠅的幼蟲和蛹。王振華等(2008)采用PCR方法，利用ITS間斷序列分型引物，根據(jù)擴增后片段的不同，區(qū)分橘大實蠅Bactroceraminax(Enderlein)與橘小實蠅?？浊锷彽?2010)利用特異的嵌套式引物對橘小實蠅18S rDNA基因片段進行擴增和序列比對分析，成功鑒定了柑橘果實中橘小實蠅的卵。

表1 實蠅DNA條形碼的應用情況Table 1 The application of DNA barcoding for fruit fly identification

2. 2 Real-time PCR技術

2. 2. 1 原理及特點 Real-time PCR，即實時熒光定量PCR技術，于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。所謂實時熒光定量PCR技術，即指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法(歐陽松應等，2004)。與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、能有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。目前該技術已得到廣泛應用。

2. 2. 2 國內(nèi)外研究進展 余道堅等(2006)基于mtDNA COⅠ設計引物，建立了SYBR Green實時熒光PCR技術快速鑒定辣椒實蠅Bactroceralatifrons(Hendel)的方法。Fengetal.(2007)基于mtDNA COⅠ，應用實時熒光定量PCR技術成功鑒定了三葉斑潛蠅Liriomyzatrifolii(Burgess)幼蟲。徐浪等(2010)基于mtDNA COⅠ設計6條特異性引物，應用AllGlo實時熒光PCR方法成功鑒定了南美按實蠅Anastrephafraterculus(Wiedemann)、墨西哥按實蠅Anastrephaludens(Loew)、西印度按實蠅Anastrephaoblique(Macquart)、印加按實蠅AnastrephadistinctaGreene、中美按實蠅AnastrephastriataSchiner等6種重要的按實蠅。

2. 3 RFLP(restriction fragment length polymorphism)技術

2. 3. 1 原理及特點 RFLP，即限制性片段長度多態(tài)性技術，于1980年由Bostein建立并發(fā)展起來。它是指利用限制性內(nèi)切酶酶解樣品DNA從而產(chǎn)生不同長度的DNA片，進而通過電泳將不同長度的DNA片段分離出來(周延清，2005)。該技術具有多態(tài)性豐富、對基因組的覆蓋范圍比較廣等優(yōu)點，但存在成本昂貴、操作繁瑣、檢測周期長等缺點。

2. 3. 2 國內(nèi)外研究進展 Muraji & Nakahara (2002)應用RFLP技術研究了亞太地區(qū)18種實蠅的快速鑒定方法，結果表明，除了楊桃實蠅BactroceracarambolaeDrew & Hancock和木瓜實蠅BactrocerapapayaeDrew & Hancock，該方法可準確鑒別其他16種實蠅害蟲。吳佳教等(2004)研究表明，RFLP技術適用于橘小實蠅、銹實蠅Bactrocerarubigina(Wang & Zhao)、瓜實蠅Bactroceracucurbitae(Coquillett)、南瓜實蠅Bactroceratau(Walker)、具條實蠅Bactrocerascutellata(Hendel)及木姜子實蠅BactrocerahyalineShiraki等6種實蠅的快速鑒定。吳佳教等(2005)應用RFLP技術，對我國口岸截獲頻率較高的9種檢疫性實蠅進行了快速鑒定。林麗莉等(2007)應用RFLP技術，對我國部分地區(qū)發(fā)生分布的蜜柑大實蠅Bactroceratsuneonis(Miyake)和橘大實蠅開展了分子生物學鑒定方法的研究并取得成功。Chuaetal.(2010)采用RFLP技術成功區(qū)分了楊桃實蠅和木瓜實蠅，進而使橘小實蠅復合種的有效識別得以實現(xiàn)。

2. 4 RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)技術

2. 4. 1 原理及特點 RAPD，即隨機擴增多態(tài)性DNA技術，由美國杜邦公司和加利福尼亞生物研究所在1900年提出(Welsh & McClelland，1990；Williamsetal.，1990)。它以一種或多種隨機引物對模板DNA進行隨機擴增，是建立在PCR基礎上研究模板DNA多態(tài)性的遺傳標記技術。其基本原理是利用人工合成的短核苷酸(大約10個堿基)對DNA靶序列進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行電泳分離及溴化乙錠染色就可檢測出DNA靶序列的多態(tài)性(溫孚江，2002)。該技術具有操作簡便易行、分析快捷方便、不用專門設計引物及引物數(shù)量不限等優(yōu)點，但是存在穩(wěn)定性差、重復性差、易出現(xiàn)假帶等缺點。

2. 4. 2 國內(nèi)外研究進展 Haymer & McInnis (1994)應用RAPD技術鑒定了地中海實蠅Ceratitiscapitata(Wiedemann)，認為RAPD技術可用于證明害蟲同一種群和不同種群間的遺傳變異。張紅梅等(2004)利用RAPD技術對陜西省常見4種實蠅基因組DNA的多態(tài)性進行了初步研究。張亮和張智英(2007)采用RAPD技術鑒定了南瓜實蠅、黑漆實蠅Bactrocerascutellaris(Bezzi)、具條實蠅、瓜實蠅、橘小實蠅和番石榴實蠅等6種實蠅。

2. 5 AFLP(amplified fragment length polymorphism)技術

2. 5. 1 原理及特點 AFLP，即擴增片段長度多態(tài)性技術，是一種基于PCR技術的選擇性擴增限制性片段的方法，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后在限制性片段兩端連接人工接頭作為擴增的模板，接頭序列和相鄰的限制性位點序列作為引物結合位點(鞠秀芝等，2005)。該技術具有快速高效、多態(tài)性豐富、可靠性好等優(yōu)點，但同時存在分析成本高、對樣本DNA質量要求較高等缺點。

2. 5. 2 國內(nèi)外研究進展 Kakouli-Duarteetal.(2001)采用AFLP技術準確區(qū)分了地中海實蠅和納塔爾小條實蠅CeratitisrosaKarsch。我國暫無相關報道。

2. 6 基因芯片技術

2. 6. 1 原理及特點 基因芯片是生物芯片的一種，又被稱作DNA芯片。其工作原理：經(jīng)過標記的待測樣本DNA與位于芯片上特定位置的探針雜交，根據(jù)堿基互補配對的原則確定靶DNA序列，最后經(jīng)激光共聚集顯微鏡掃描，利用計算機系統(tǒng)對熒光信號進行比較和檢測進而迅速得出所需信息(馮永強和閻小君，2000)。該技術具有快速高效、高通量、微型化以及自動化等優(yōu)點，但同時存在技術復雜、成本昂貴、檢測靈敏度低、重復性差及分析范圍較窄等缺點。

2. 6. 2 國內(nèi)外研究進展 李文芬等(2008)選擇mtDNA COⅠ作為分子標記基因，建立了地中海實蠅、芒果小條實蠅Ceratitiscosyra(Walker)以及納塔爾小條實蠅等實蠅科重要害蟲的生物芯片檢測方法。國外暫未發(fā)現(xiàn)相關文獻。

3 問題與展望

近年來，分子生物學技術不斷發(fā)展，其在昆蟲分類中的應用也越來越廣，這些技術不僅驗證了傳統(tǒng)分類所得出的結論，而且解決了傳統(tǒng)分類所無法解決的疑難問題，均顯示出分子生物學技術的優(yōu)勢及廣闊的發(fā)展前景。

雖然分子生物學技術具有準確、客觀等特點，即分子序列的信息代表遺傳的本質，它不受物種個體發(fā)育階段及環(huán)境條件等的影響，但同時存在許多問題。首先，從龐大的DNA文庫中選擇最佳、最能反映物種間進化關系的基因片段仍存在較大難度；其次，選擇不同的目的基因研究同一物種，可能會得到不同的結果；再次，使用不同的分子生物學分析軟件有可能得出不同的結果。這些問題是今后昆蟲分類研究的重要課題。

崔俊霞, 徐瑛, 聞偉剛, 陳先鋒, 張同心. 2006. 橘小實蠅快速檢疫鑒定方法. 昆蟲知識, 43(5): 731-733.

馮永強, 閻小君. 2000. 基因芯片技術. 國外醫(yī)學: 分子生物學分冊, 22(1): 1-5.

黃振. 2010. 果實蠅屬重要種的鑒定、人工飼料篩選、適生性預測和風險分析. ?？冢?海南大學.

黃振， 郭瓊霞, 吳淇銘, 黃可輝. 2014. 番石榴果實蠅形態(tài)、危害與入侵中國的風險. 江西農(nóng)業(yè)學報， 26(4): 61-63.

黃振, 黃可輝. 2012. 果蔬重要實蠅屬的分布、危害與形態(tài)特征比較研究. 江西農(nóng)業(yè)學報, 24(3): 73-75.

黃振, 梁軍, 張旺珍. 2012. 我國首次截獲檢疫性有害生物——腿端黑實蠅. 植物檢疫, 26(6): 94-99.

姜帆, 劉佳琪, 李志紅, 吳佳教, 趙朔. 2011. 基于DNA條形碼的廣西苦瓜中實蠅幼蟲分子鑒定研究. 植物保護, 37(4)： 150-153.

鞠秀芝, 杜勝利, 宗兆鋒, 張桂華, 韓毅科, 王鳴. 2004. AFLP技術及其常見問題與解決方案. 天津農(nóng)業(yè)科學, 10(4): 6-9.

孔秋蓮, 葉軍, 岳玲, 陳志軍, 包英姿, 徐赟, 郭卡, 袁忠誼, 戚文元. 2010. 快速檢測水果中桔小實蠅卵的分子診斷方法研究. 華北農(nóng)學報, 25(1): 226-230.

李文芬, 余道堅, 顏亨梅, 李建光, 徐浪, 任魯風. 2008. 地中海實蠅及其近緣種基因芯片檢測研究. 昆蟲學報, 51(1): 61-67.

李志紅, 吳佳教, 劉佳琪. 2011. 基于DNA條形碼技術的泰國番石榴中實蠅幼蟲分子鑒定研究. 植物檢疫, 25(1): 49-52.

梁廣勤, 梁帆, 趙菊鵬, 胡學難, 吳佳教. 2008. 中國實蠅檢疫研究概況. 環(huán)境昆蟲學報， 30(4)： 361-369.

林麗莉, 吳佳教, 曾玲, 梁廣文, 胡學難, 莫仁浩. 2007. 二種大實蠅的PCR-RFLP快速鑒定方法. 昆蟲知識, 44(16): 588-592.

劉慎思, 張桂芬, 武強, 張愛兵, 王進軍, 萬方浩. 2012. 桔小實蠅幼體及成蟲殘體DNA條形碼識別技術的建立與應用. 昆蟲學報, 55(3): 336-343.

歐陽松應, 楊冬, 歐陽紅生, 馬鶴雯. 2004. 實時熒光定量PCR技術及其應用. 生命的化學, 24(1): 74-76.

王廷華, 景強, Dubus P. 2005. PCR理論與技術. 北京： 科學出版社.

王振華, 馮漢利, 呂志藻, 趙暉, 郭明星, 朱堂明, 曾憲東, 陳建軍. 2009. 實蠅類昆蟲檢測技術研究進展. 湖北植保, 112(2): 28-30.

王振華, 朱堂明, 呂志藻, 郭明星, 陳建軍, 趙暉. 2008. 用PCR方法鑒定區(qū)分柑橘大實蠅與橘小實蠅. 植物檢疫, 22(3): 155-157.

溫孚江. 2002. 農(nóng)業(yè)生物技術. 北京： 中國科學技術出版社.

吳佳教, 胡學難, 趙菊鵬, 梁帆, 梁廣勤. 2005. 9種檢疫性實蠅PCR-RFLP快速鑒定研究. 植物檢疫, 19(1): 2-6.

吳佳教, 梁帆, 胡學難, 趙菊鵬, 梁廣勤. 2004. 我國南方常見的6種寡毛實蠅PCR-RFLP快速鑒定研究. 江西農(nóng)業(yè)大學學報, 26(5): 770-773.

徐浪, 余道堅, 李建光, 王銀竹, 陳志粦. 2010. AllGlo實時熒光PCR快速檢測6種按實蠅. 植物檢疫, 24(5): 18-21.

余道堅, 鄧中平, 陳志粦, 焦懿, 章桂明, 康林, 楊偉東, 金顯忠. 2004. PCR法檢疫鑒定番石榴實蠅. 植物檢疫, 18(2): 73-76.

余道堅, 章桂明, 陳志粦, 康林, 楊偉東. 2006. SYBR Green實時熒光PCR快速鑒定辣椒實蠅. 植物檢疫, 20(1): 10-14.

張紅梅, 潘亞勤, 魏迪功, 仵均祥. 2004. 陜西省常見四種實蠅的 RAPD 研究初報(雙翅目: 實蠅科). 昆蟲分類學報, 26(1): 59-63.

張亮, 張智英. 2007. 云南六種實蠅的RAPD快速鑒定. 應用生態(tài)學報, 18(5): 1163-1166.

周延清. 2005. DNA分子標記技術在植物研究中的應用. 北京： 化學工業(yè)出版社.

Abd-El-Samie E M and El Fiky Z A. 2011. Molecular phylogeny and identification of the peach fruit fly,Bactrocerazonata, established in Egypt.JournalofInsectScience, 11： 117.

Chua T H, Chong Y V and Lim S H. 2010. Species determination of MalaysianBactrocerapests using PCR-RFLP analyses (Diptera: Tephritidae).PestManagementScience, 66: 379-384.

Feng X, Chen N Z, Ma J, Zhu S F and Hu X N. 2007. Molecular identification ofLiriomyzatrifolii(Burgess) (Dipt., Agromyzidae) based on real-time PCR.JournalofAppliedEntomology, 131: 548-552.

Haymer D S and McInnis D O. 1994. Resolution of populations of the Mediterranean fruit fly at the DNA level using random primers for the polymerase chain reaction.Genome, 37: 244-248.

Hebert P D, Cywinska A and Ball S L. 2003. Biological identifications through DNA barcodes.ProceedingsoftheRoyalSocietyofLondon.SeriesB:BiologicalSciences, 270: 313-321.

Jiang F, Li Z H, Deng Y L, Wu J J, Liu R S and Buahom N. 2013. Rapid diagnosis of the economically important fruit fly,Bactroceracorrecta(Diptera: Tephritidae) based on a species-specific barcoding cytochrome oxidase Ⅰ marker.BulletinofEntomologicalResearch, 103: 363-371.

Kakouli-Duarte T, Casey D and Burnell A. 2001. Development of a diagnostic DNA probe for the fruit fliesCeratitiscapitataandCeratitisrosa(Diptera: Tephritidae) using amplified fragment-length polymorphism.JournalofEconomicEntomology, 94: 989-997.

Liang L, Jiang W and Yu H. 2011. Identification of ChineseBactroceraspecies through DNA barcoding (Diptera, Tephritidae).ActaZootaxonomicaSinica, 36: 925-932.

Lin C P and Danforth B N. 2004. How do insect nuclear and mitochondrial gene substitution patterns differ? Insights from Bayesian analyses of combined datasets.MolecularPhylogeneticsandEvolution, 30: 686-702.

Liu L, Liu J, Wang Q, Ndayiragije P, Ntahimpera A, Nkubaye E, Yang Q and Li Z. 2011. Identification ofBactrocerainvadens(Diptera: Tephritidae) from Burundi, based on morphological characteristics and DNA barcode.AfricanJournalofBiotechnology, 10: 13623-13630.

Muraji M and Nakahara S. 2002. Discrimination among pest species ofBactrocera(Diptera: Tephritidae) based on PCR-RFLP of the mitochondrial DNA.AppliedEntomologyandZoology， 37: 437-446.

Welsh J and McClelland M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers.NucleicAcidsResearch, 18: 7213-7218.

Williams J G, Kubelik A R, Livak K J, Rafalski J A and Tingey S V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.NucleicAcidsResearch, 18: 6531-6535.