任路明， 王 磊， 于 毅， 褚 棟*

1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護學(xué)院，山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，山東 青島 266109；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，山東 濟南 250100

鈴木氏果蠅DrosophilasuzukiiMatsumura(又稱斑翅果蠅)隸屬雙翅目Diptera環(huán)列亞目Cyclorrhapha果蠅科Drosophilidae果蠅屬Drosophila水果果蠅亞屬Sophophora，是一種重要水果害蟲。其寄主范圍廣，繁殖速度快，傳播迅速，對水果生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失(馬聰慧等，2014； 吳軍等，2013; Cinietal.，2012； Hauser，2011)。鈴木氏果蠅最早于1916年在日本山梨縣草莓園中發(fā)現(xiàn)(孫鵬等，2011； 于毅等，2013)。近年來入侵南北美洲、歐洲等許多國家并造成嚴重危害(Cinietal.，2012; Hauser，2011)，因此備受世界各國的廣泛關(guān)注。在北美洲，該蟲自2008年在美國本土加利福尼亞沃森維爾地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)以來，俄勒岡州、華盛頓州、佛羅里達州、路易斯安那州、北卡羅來納州、南卡羅來納州以及猶他州等州也相繼發(fā)現(xiàn)其危害，呈現(xiàn)迅速擴散蔓延之勢(EPPO，2010)。在南美洲，1998年厄爾瓜多國家零星出現(xiàn)了鈴木氏果蠅(Calabriaetal.，2012)。2013年，在南美洲巴西的新韋內(nèi)扎發(fā)現(xiàn)鈴木氏果蠅，隨后又在巴西的埃雷欣、維拉瑪麗亞等地相繼發(fā)現(xiàn)該蟲(Depraetal.，2014)。在歐洲，自2008年秋季首次在西班牙發(fā)現(xiàn)鈴木氏果蠅后，在歐洲各地不斷擴散蔓延(Calabriaetal.，2012； Grassietal.，2009； Kissetal.，2013; Rossi Stacconietal.，2013)。

在中國，鈴木氏果蠅是黑腹果蠅復(fù)合種中分布最廣的物種之一，目前至少在黑龍江、山東、浙江、廣西、貴州、西藏、臺灣等22個省(自治區(qū))發(fā)現(xiàn)了該蟲(錢遠槐等，2006; Linetal.，1977)，近年來其危害也呈現(xiàn)不斷加重的趨勢(代侃韌，2013)。鈴木氏果蠅寄主植物廣泛，已知寄主涉及18個科60多種水果(孫鵬等，2011； Boldaetal.，2010； Leeetal.，2011； Richardetal.，2010)。我國于1997年首次在甘肅省天水市發(fā)現(xiàn)果蠅危害甜櫻桃。經(jīng)調(diào)查，危害甜櫻桃的果蠅除鈴木氏果蠅之外，還有黑腹果蠅DrosophilamelanogasterMeigen、海德氏果蠅Drosophilahydei(Sturtevant)、伊米果蠅Drosophilaimmigrans(Sturtevant)(郭建明，2007； 劉坤，2014)。在櫻桃上也發(fā)現(xiàn)了鈴木氏果蠅與黑腹果蠅、海德氏果蠅混合發(fā)生的情況(郭麗娜等，2014)。因此，不同果蠅的種類鑒定對于果蠅監(jiān)控具有重要的指導(dǎo)價值。

前人對鈴木氏果蠅不同發(fā)育階段的形態(tài)特征進行了具體的描述(林清彩等，2013; 孫鵬等，2011； Kikkawa & Peng，1938)。劉坤(2014)詳細描述了黑腹果蠅、伊米果蠅、鈴木氏果蠅、海德氏果蠅4種果蠅成蟲的形態(tài)特征。為了能夠快速鑒別這4種重要水果果蠅，本文在綜合前人形態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)上，對其成蟲形態(tài)進行比較研究，并進一步利用線粒體COⅠ(mtCOⅠ)基因?qū)壩锓N進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

試驗所用的黑腹果蠅、鈴木氏果蠅、海德氏果蠅、伊米果蠅分別采自云南昆明、山東威海、山東淄博和山東臨沂。采集方式為誘捕法(伍蘇然等，2007； 熊偉等，2014； Chaetal.，2012； Kleiberetal.，2014)。樣品保存在無水乙醇中，在實驗室于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 成蟲形態(tài)特征觀察與比較

將供試果蠅放在培養(yǎng)皿或載玻片上，置于Nikon顯微鏡下，使用電源光(冷光源XD-301)或在自然光較亮的環(huán)境下，調(diào)整成蟲的前翅、前足、腹部、產(chǎn)卵器的角度，觀察比較種間雄蟲前翅和前足以及雌蟲腹部和產(chǎn)卵器形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異,以確定果蠅種類(郭迪金等，2007; 林清彩等，2013)。同時，利用TOUPCAM顯微鏡攝影裝置對果蠅的鑒別特征進行拍攝，以便更加系統(tǒng)直觀地識別與區(qū)分不同種類的果蠅。

1.3 mtCOⅠ基因擴增

在果蠅種類形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用以mtCOⅠ基因作為分子標記的分子鑒定法(張開春等，2014)進一步驗證形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。以果蠅的部分肌肉組織作為DNA提取材料，每個果蠅種群提取2頭，提取方法參照禇棟等(2005)。所用引物為LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)/HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACC-AAAAAATCA-3′)(Folmeretal.，1994)，其擴增產(chǎn)物大小為700 bp左右。PCR擴增體系：基因組DNA溶液3 μL,20 μmol·L-1引物0.5 μL,5 U·μL-1Taq酶0.25 μL,10×TaqBuffer(緩沖液)2.5 μL,10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL,ddH20補至25 μL。PCR擴增參數(shù)：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，49～55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物與2 μL loading buffer混勻，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。將擴增的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。利用BLASTX對測序結(jié)果進行序列比對，比較其結(jié)果是否與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

1.4 序列分析

測序成功后，從GenBank中選擇鈴木氏果蠅、黑腹果蠅、海德氏果蠅、伊米果蠅各2條序列，登錄號：鈴木氏果蠅KJ671622、KJ671621，黑腹果蠅FJ190110、FJ190109，海德氏果蠅KJ671603、KJ671602，伊米果蠅EF570021、JQ679115。以煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)mtCOⅠ序列(登錄號為JQ906700)為外群，通過Clustal W軟件(Thompsonetal.，1994)比對本研究中獲得的序列與上述序列，利用MEGA 5.0軟件(Tamuraetal.，2007)根據(jù)Kimura 2-Paramter模型計算出不同種類果蠅的進化分歧矩陣，采用非加權(quán)配對算數(shù)平均法(UPGMA)構(gòu)建系統(tǒng)樹，分別將系統(tǒng)樹各分支置信度(bootstrap)進行1000次重復(fù)檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同果蠅成蟲鑒別特征

對鈴木氏果蠅、黑腹果蠅、海德氏果蠅、伊米果蠅雄性成蟲主要觀察前翅、前足的特征；對雌蟲則主要觀察其腹部、產(chǎn)卵器的特征(表1)。

表1 4種果蠅的鑒別特征信息Table 1 Information of the identification features of four Drosophila species

鈴木氏果蠅雄蟲翅前緣頂角處有黑斑，而其他3種果蠅無黑斑(圖1)；鈴木氏果蠅雄蟲前足第一跗節(jié)和第二跗節(jié)分別有一簇性梳，黑腹果蠅雄蟲前足第一跗節(jié)具一黑色性梳，海德氏果蠅雄蟲前足跗節(jié)無性梳，而伊米果蠅雄蟲前足腿節(jié)內(nèi)側(cè)具有一列楔形小齒列(圖2)。

圖1 4種果蠅雄蟲前翅的鑒別特征Fig.1 Comparison of identification features of the male forewing in four Drosophila speciesA～D：分別為鈴木氏果蠅、黑腹果蠅、海德氏果蠅、伊米果蠅雄蟲前翅。A～D： Forewing of male D.suzukii, D.melanogaster, D.hydei, and D.immigrans, respectively.

圖2 4種果蠅雄蟲前足的鑒別特征Fig.2 Comparison of identification features of the male forefeet in four Drosophila speciesA～D：分別為鈴木氏果蠅、黑腹果蠅、海德氏果蠅、伊米果蠅雄蟲前足。A～D： Forefeet of male D.suzukii, D.melanogaster, D.hydei, and D.immigrans, respectively.

鈴木氏果蠅雌蟲腹部腹節(jié)背面有不間斷黑色條帶，腹末具黑色環(huán)紋，黑腹果蠅雌蟲腹部背面有明顯的5條不間斷黑色條紋，海德氏果蠅雌蟲腹部背板后緣5條黑帶中間斷開，伊米果蠅雌蟲腹部基部4節(jié)端部具不連續(xù)的黑色橫帶，第五腹節(jié)黑色(圖3)；鈴木氏果蠅雌蟲產(chǎn)卵器呈明顯黑色鋸齒狀，而其他3種果蠅雌蟲產(chǎn)卵器非黑色鋸齒狀(圖4)。

圖3 4種果蠅雌蟲腹部的鑒別特征Fig.3 Comparison of identification features of the female abdomen in four Drosophila speciesA～D：分別為鈴木氏果蠅、黑腹果蠅、海德氏果蠅、伊米果蠅雌蟲腹部。A～D： Abdomen of female D.suzukii, D.melanogaster, D.hydei, and D.immigrans, respectively.

圖4 4種果蠅雌蟲產(chǎn)卵器的鑒別特征Fig.4 Comparison of identification features of the female ovipositor in four Drosophila speciesA～D：分別為鈴木氏果蠅、黑腹果蠅、海德氏果蠅、伊米果蠅雌蟲產(chǎn)卵器。A～D： Ovipositor of female D.suzukii, D.melanogaster, D.hydei, and D.immigrans, respectively.

2.2 基于mtCOⅠ基因?qū)壍姆肿予b定

結(jié)果表明，4種果蠅樣品DNA均擴增成功，擴增片段長度均在700 bp左右，片段長度與預(yù)期結(jié)果相同(圖5)。

圖5 4種果蠅的mtCOⅠ片段擴增圖Fig.5 PCR amplification of mtCOⅠ fragments of four Drosophila species1～2： 威海鈴木氏果蠅； 3～4： 云南黑腹果蠅； 5～6： 淄博海德氏果蠅；7～8： 臨沂伊米果蠅； M： DL2000 DNA標準分子質(zhì)量。1～2： D.suzukii； 3～4： D.melanogaster； 5～6： D.hydei； 7～8： D.immigrans； M： DL2000 DNA Marker.

從進化分歧矩陣(表2)可以看出，威海鈴木氏果蠅與GenBank中鈴木氏果蠅遺傳距離小于0.3%；云南黑腹果蠅與GenBank中黑腹果蠅遺傳

距離為0.0%；淄博海德氏果蠅與GenBank中海德氏果蠅遺傳距離為0.0%；臨沂伊米果蠅與GenBank中伊米果蠅遺傳距離為0.5%；威海鈴木氏果蠅與云南黑腹果蠅遺傳距離小于9.3%；威海鈴木氏果蠅與淄博海德氏果蠅遺傳距離為15.1%；威海鈴木氏果蠅與臨沂伊米果蠅的遺傳距離為11.5%。由系統(tǒng)樹(圖6)可見，威海鈴木氏果蠅2條序列與GenBank中2條鈴木氏果蠅序列聚在一起；云南黑腹果蠅2條序列與GenBank中2條黑腹果蠅序列聚在一起；臨沂伊米果蠅2條序列與GenBank中2條伊米果蠅序列聚在一起；淄博海德氏果蠅1條序列與GenBank中2條海德氏果蠅序列聚在一起。建樹結(jié)果與形態(tài)觀察結(jié)果完全一致。

表2 基于mtCOⅠ基因的4種果蠅的遺傳距離Table 2 Genetic distance of the four Drosophila species based on mtCOⅠ

1～2：威海鈴木氏果蠅2條線粒體COⅠ基因序列(WHGY1， WHGY2)； 3～4： GenBank中2條鈴木氏果蠅線粒體COⅠ基因序列(KJ671622-Dsuz， KJ671621-Dsuz)； 5～6：云南黑腹果蠅2條線粒體COⅠ基因序列(YNGY1， YNGY2)； 7～8： GenBank中2條黑腹果蠅線粒體COⅠ基因序列(FJ190110-Dmel， FJ190109-Dmel)； 9：淄博海德氏果蠅1條線粒體COⅠ基因序列(ZBGY1)； 10～11： GenBank中2條海德氏果蠅線粒體COⅠ基因序列(KJ671603-Dhyd， KJ671602-Dhyd)； 12～13：臨沂伊米果蠅2條線粒體COⅠ基因序列(LYGY1， LYGY2)； 14～15： GenBank中2條伊米果蠅線粒體COⅠ基因序列(EF570021-Dimm， JQ679115-Dimm)。

1～2： Two mitochondrialCOⅠ gene sequences of WeihaiD.suzukii(WHGY1， WHGY2)； 3～4： TwoD.suzukiimitochondrialCOⅠ gene sequences in GenBank (KJ671622-Dsuz, KJ671621-Dsuz)； 5～6: Two mitochondrialCOⅠ gene sequences of YunnanD.melanogaster(YNGY1, YNGY2)； 7～8: TwoD.melanogastermitochondrialCOⅠ gene sequences in GenBank (FJ190110-Dmel, FJ190109-Dmel)； 9: Two mitochondrialCOⅠ gene sequences of ZiboD.hydei(ZBGY1)； 10～11: TwoD.hydeimitochondrialCOⅠ gene sequences in GenBank (KJ671603-Dhyd, KJ671602-Dhyd)； 12～13: Two mitochondrialCOⅠ gene sequences of LinyiD.immigrans(LYGY1, LYGY2)； 14～15: TwoD.immigransmitochondrialCOⅠ gene sequences in GenBank(EF570021-Dimm, JQ679115-Dimm).

3 討論

由于鈴木氏果蠅、黑腹果蠅、海德氏果蠅、伊米果蠅4種果蠅常在水果產(chǎn)區(qū)混合發(fā)生(郭麗娜等，2014),研究這4種果蠅的形態(tài)特征有利于對其快速鑒別。本研究表明，鈴木氏果蠅雄蟲翅前緣頂角處有黑斑，且其前足第一和第二跗節(jié)有一簇性梳；雌蟲腹節(jié)背面有不間斷黑色條帶，產(chǎn)卵器呈黑色鋸齒狀。這些是區(qū)分鈴木氏果蠅與其他3種果蠅的重要形態(tài)特征。此外，剛羽化的鈴木氏果蠅雄蟲黑斑不明顯或未顯現(xiàn)(林清彩等，2013； 劉坤，2014； 張開春等，2014)，可通過其他特征進行鑒別。

圖6基于mtCOⅠ基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹(利用UPGMA方法)
Fig.6 Phylogenetic tree constructed usingmtCOⅠ gene based on the UPGMA method
WHGY1, WHGY2: 威海鈴木氏果蠅2條線粒體COⅠ基因序列; KJ671622-Dsuz, KJ671621-Dsuz: GenBank中2條鈴木氏果蠅線粒體
COⅠ基因序列; YNGY1, YNGY2: 云南黑腹果蠅2條線粒體COⅠ基因序列； FJ190110-Dmel, FJ190109-Dmel: GenBank中2條黑腹
果蠅線粒體COⅠ基因序列； ZBGY1: 淄博海德氏果蠅線粒體COⅠ基因序列； KJ671603-Dhyd, KJ671602-Dhyd: GenBank中2條
海德氏果蠅線粒體COⅠ基因序列； LYGY1, LYGY2: 臨沂伊米果蠅2條線粒體COⅠ基因序列； EF570021-Dimm,
JQ679115-Dimm: GenBank中2條伊米果蠅線粒體COⅠ基因序列； Outgroup: 煙粉虱線粒體COⅠ基因序列。
WHGY1, WHGY2: WeihaiD.suzukii； KJ671622-Dsuz, KJ671621-Dsuz:D.suzukiimitochondrial COⅠ gene sequences in GenBank；
YNGY1, YNGY2: YunnanD.melanogaster; FJ190110-Dmel, FJ190109-Dmel:D.melanogastermitochondrial COⅠ gene
sequences in GenBank； ZBGY1: ZiboD.hydei； KJ671603-Dhyd, KJ671602-Dhyd:D.hydeimitochondrial COⅠ gene
sequences in GenBank； LYGY1, LYGY2: LinyiD.immigrans； EF570021-Dimm, JQ679115-Dimm:D.immigrans
mitochondrial COⅠ gene sequences in GenBank. Outgroup:Bemisiatabacimitochondrial COⅠ gene sequences in GenBank.

對于果蠅的幼蟲或蛹，應(yīng)用形態(tài)學(xué)難以快速區(qū)分，尚需進一步開展分子鑒定技術(shù)研究。在水果產(chǎn)區(qū)往往是幾種果蠅混合發(fā)生，然而并不是所有發(fā)生的果蠅都會對水果生產(chǎn)造成影響，因此，在對果區(qū)發(fā)生的果蠅種類進行鑒定后應(yīng)進一步研究確定其主要危害種，從而更經(jīng)濟有效地防控果蠅危害。

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