張桂芬， 喬瑋娜， 古君伶， 閔 亮， 萬(wàn)方浩

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2農(nóng)業(yè)部外來(lái)入侵生物預(yù)防與控制研究中心，北京100193； 3北京市順義區(qū)植保植檢站，北京101300

西花薊馬Frankliniellaoccidentalis(Pergande)，又稱苜蓿薊馬alfalfa thrips，屬薊馬科Thripidae花薊馬屬Frankliniella，原產(chǎn)于加拿大西部和美國(guó)北部，最早記載于1895年，是美國(guó)加利福尼亞州的常見(jiàn)害蟲(chóng)(Beshear, 1983)。隨著加州花卉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，西花薊馬隨花卉及其產(chǎn)品的銷售，擴(kuò)散蔓延至賓夕法尼亞州(1966年)、堪薩斯州(1971年)、北卡羅來(lái)納州(1977年)、路易斯安那州(1983年)等地(任潔, 2006)。迄今，西花薊馬已遍布美國(guó)50個(gè)州(Rugman-Jonesetal., 2010)。同時(shí)，隨著國(guó)際貿(mào)易往來(lái)的日趨頻繁，該蟲(chóng)隨花卉和蔬菜的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸迅速向世界各地?cái)U(kuò)散。1983年，西花薊馬首次在荷蘭溫室的非洲堇SaintpauliaionanthaWendl上被發(fā)現(xiàn)，而后迅速在歐洲南部地區(qū)建立種群(Brodsgaard, 1993; Kirk & Terry 2003; Vierbergen, 1999)。之后，該薊馬又先后在以色列(1987年)(Argamanetal., 1989)、南非(1987年)(Giliomee, 1989)、馬來(lái)西亞(1989年)(Fauziah & Saharan, 1991)、日本(1990年)(Hayase & Fukuda, 1991)、澳大利亞(1993年)(Malipatiletal., 1993)、韓國(guó)(1994年)(Chungetal., 2000)等國(guó)發(fā)現(xiàn)，并在局部地區(qū)造成嚴(yán)重危害。目前，西花薊馬已成為世界范圍內(nèi)嚴(yán)重制約蔬菜、花卉、果樹(shù)等產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要害蟲(chóng)之一(Gerinetal., 1994; Kirk & Terry, 2003)。

早在1997年，我國(guó)就將西花薊馬列入《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫潛在危險(xiǎn)性病、蟲(chóng)、雜草名錄(試行)》[動(dòng)植檢植字(1997)33號(hào)]。我國(guó)于2003年7月在北京郊區(qū)的溫室辣椒上發(fā)現(xiàn)西花薊馬(張友軍等，2003)，之后又在云南(2005年)(徐家菊等, 2005)、貴州(2006年)(袁成明等, 2008)、山東(2007年)(鄭長(zhǎng)英等, 2007)、黑龍江(2007年)(武曉云等, 2009)、湖南(2008年)(劉佳等, 2010)、南京(2008年)(嚴(yán)丹侃等, 2010)、新疆(2010年)(楊華等, 2010)、西藏(2012)(王海鴻等, 2013)等地相繼有西花薊馬發(fā)生的報(bào)道。

以往的研究顯示，西花薊馬有2個(gè)品系，即溫室品系(glasshouse strain)和羽扇豆品系(lupin strain)(Brunner & Frey, 2010; Rugman-Jonesetal., 2010)。其中，溫室品系源于美國(guó)加利福尼亞州，20世紀(jì)80年代，西花薊馬從美國(guó)傳入荷蘭溫室蔬菜和花卉集散地后，迅速向整個(gè)歐洲和非洲南部蔓延，在當(dāng)?shù)匦纬煽顾幮暂^強(qiáng)的溫室品系(Kirk & Terry, 2003)。羽扇豆品系源于新西蘭，早在19世紀(jì)30年代從美國(guó)加利福尼亞州隨羽扇豆傳入新西蘭(Kirk & Terry, 2003; Martin & Workman, 1994)，只危害羽扇豆類植物，對(duì)其他作物沒(méi)有危害(Martin & Workman, 1994)；20世紀(jì)90年代，羽扇豆品系傳至整個(gè)美國(guó)北部和加拿大南部(Kirk & Terry 2003; Rugman-Jonesetal., 2010)。有研究顯示，西花薊馬的2個(gè)品系在體色、抗寒性、抗藥性等方面均有很大區(qū)別(Fellandetal.,1993; Kirk & Terry, 2003; Martin & Workman, 1994; Tsumukietal., 2007)。

入侵害蟲(chóng)的遺傳多樣性及其擴(kuò)張趨勢(shì)研究，是入侵生物學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一(萬(wàn)方浩等, 2005)。Fangetal.(2005)利用AFLP(amplified fragment length polymorphisim)技術(shù)分析以色列不同地理種群西花薊馬的遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)各種群內(nèi)部具有很高的遺傳多樣性。張治軍(2007)利用該技術(shù)研究西花薊馬7個(gè)不同地理種群(北京、云南、新西蘭、荷蘭、美國(guó)、澳大利亞和日本)，分析結(jié)果表明，不同地區(qū)的西花薊馬種群之間存在明顯的遺傳分化；聚類分析結(jié)果顯示，北京種群與荷蘭種群聚為一支，推測(cè)北京的西花薊馬可能來(lái)自荷蘭。沈榮登等(2011)應(yīng)用核糖體DNA中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2(internal transcribed spacer 2)基因序列對(duì)云南各地理種群西花薊馬的遺傳結(jié)構(gòu)及其分化進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明各地理種群間的遺傳分化程度很低，種群間存在基因交流。

本研究針對(duì)西花薊馬在我國(guó)傳播擴(kuò)散迅速但其遺傳結(jié)構(gòu)尚不明晰的問(wèn)題，以采自我國(guó)13個(gè)地理區(qū)域的西花薊馬為靶標(biāo)，采用COⅠ分子標(biāo)記技術(shù)，研究分析我國(guó)西花薊馬不同地理種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，研究結(jié)果對(duì)深入探討我國(guó)西花薊馬的入侵來(lái)源、傳播擴(kuò)散途徑及其有效阻截具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

根據(jù)入侵物種傳播擴(kuò)散的可能途徑以及我國(guó)各省/直轄市工農(nóng)業(yè)發(fā)展的特點(diǎn)，以我國(guó)經(jīng)濟(jì)比較發(fā)達(dá)的沿海城市、旅游勝地以及礦產(chǎn)資源比較豐富的地區(qū)為主要采集區(qū)域，進(jìn)行西花薊馬的系統(tǒng)采集。本研究中，供試西花薊馬樣品的采集信息如表1所示。

表1 不同地理種群西花薊馬采集信息Table 1 Collecting information of F.occidentalis from different geographical populations

*中國(guó)主要外來(lái)入侵昆蟲(chóng)DNA條形碼識(shí)別系統(tǒng)。

*Database of invasive alien species in China (http:∥www.chinaias.cn).

1.2 總DNA提取

西花薊馬總DNA的提取參照Moritzetal.(2001)的方法并稍加改進(jìn)。用軟毛毛筆輕輕挑取單頭薊馬，放在滴有20 μL提取緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl, 1 mmol·L-1EDTA, 1% SDS, 20 mmol·L-1NaCl, pH 8.0)的Parafilm膜上，以0.2 mL PCR管底部作為勻漿器，充分研磨，勻漿液移入1.5 mL離心管；用50 μL緩沖液清洗勻漿器和Parafilm膜4次，移入同一離心管；加入5 μL蛋白酶K(20 mg·mL-1)，充分混勻后于60 ℃水浴1 h(中途混勻1次)；加入220 μL氯仿/異戊醇(v∶v=24∶1)，輕柔混勻數(shù)十次后，冰浴30 min；以4 ℃、12000 r·min-1離心20 min，取上清液(約200 μL)并加入440 μL預(yù)冷無(wú)水乙醇，輕輕混勻后在-20 ℃冰箱放置30 min；取出后，于4 ℃、12000 r·min-1離心20 min，棄去上清液；加入440 μL預(yù)冷75%乙醇洗滌，4 ℃、12000 r·min-1離心15 min，棄去上清液。將離心管倒扣于潔凈濾紙上，自然干燥20 min，每管加入20 μL超純水，充分溶解后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以生物分光光度?jì)測(cè)定DNA濃度，以D260 nm/D280 nm值確定其是否被污染。

1.3 PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)以及序列測(cè)定

COⅠ基因序列擴(kuò)增所使用的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)引物L(fēng)CO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)(Folmeretal., 1994)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL，其中模板DNA 2 μL(約500 ng)，10×buffer(含Mg2+)2 μL，dNTPs(0.2 mmol·L-1)0.5 μL，上游引物和下游引物(5 pmol·L-1)各0.5 μL，Taq DNA聚合酶(1.0 U)0.2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；30個(gè)循環(huán)：94 ℃ 30 s，48 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s；最后72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加2 μL上樣緩沖液(0.25%溴酚蘭，40%蔗糖水溶液)，以DNA Marker為參照，在含有染色劑GoldView的1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離(電泳液為0.5×TBE)，85 V電泳45 min后，以GelDoc Universal Hood Ⅱ型凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。將經(jīng)電泳檢測(cè)驗(yàn)證合格的PCR產(chǎn)物送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序(單向測(cè)序)。根據(jù)標(biāo)本數(shù)量及PCR產(chǎn)物的質(zhì)量，每個(gè)地理種群檢測(cè)西花薊馬5～25頭(表1)，共計(jì)檢測(cè)175頭，并將175條序列錄入中國(guó)主要外來(lái)入侵昆蟲(chóng)DNA條形碼識(shí)別系統(tǒng)(http:∥www.chinaias.cn)(表1)。

1.4 序列分析

1.4.1 序列校對(duì)及人工比對(duì) Bioedit軟件讀取COⅠ基因序列，對(duì)每條序列的堿基進(jìn)行人工讀取和反復(fù)校對(duì)。校正后的堿基序列在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)，以確保所獲得的序列為目的基因片段。

1.4.2 遺傳多樣性分析 應(yīng)用DnaSP 5.0(Librado & Rozas, 2009)和MEGA 4.0軟件(Kumaretal., 2008)分析西花薊馬各地理種群COⅠ基因的序列特征及單倍型多樣性(haplotype diversity,Hd)。

序列特征分析主要包括序列的多態(tài)性位點(diǎn)(variable/polymorphic sites, V)、堿基組成(base composition)、轉(zhuǎn)換(transition, Ti)和顛換(transversion, Tv)位點(diǎn)數(shù)、轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率(Ti/Tv bias, R)。多態(tài)性位點(diǎn)包括自裔位點(diǎn)(singleton variable sites, Si)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(parsimony informative sites, Pi)。在DNA序列中，堿基恒定的位點(diǎn)和只出現(xiàn)一次變異的位點(diǎn)即為自裔位點(diǎn)；至少有2種變異類型在該位點(diǎn)出現(xiàn)2次或2次以上的，稱為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。堿基組成主要是指，DNA序列中4種堿基A、T、C、G的相對(duì)含量。堿基的替換方式有2種，即轉(zhuǎn)換和顛換，A與G之間或者C與T之間的替換稱為轉(zhuǎn)換，A、G與C、T之間的替換稱為顛換。

單倍型多樣性是指在給定群體中隨機(jī)抽取到2個(gè)不同單倍型的頻率，單倍型多樣性高的種群說(shuō)明其遺傳多樣性高，遺傳資源豐富。核苷酸多樣性(nucleotide diversity,π)是指在給定群體中隨機(jī)選取的COⅠ基因序列間的平均每個(gè)位點(diǎn)的核苷酸差異數(shù)目，是衡量一給定群體遺傳多態(tài)性的重要指標(biāo)，π值越大，種群的多樣性程度越高(彭奕欣和黃詩(shī)箋, 1997)。應(yīng)用DnaSP 5.0軟件分析各地理種群的單倍型多樣性和核苷酸多樣性(Librado & Rozas, 2009)，同時(shí)進(jìn)行Tajima′s D中性檢驗(yàn)，以明確其是否遵循中性模型(Tajima, 1989)。

1.4.3 遺傳分化和基因流分析 固定指數(shù)(genetic fixations index,Fst)表示不同種群間等位基因頻率的變異，是反映種群進(jìn)化歷史的重要參數(shù)，可在一定程度上揭示種群間基因流和遺傳漂變的程度?；蛄?gene flow,Nm)指基因在種群內(nèi)和種群間的運(yùn)動(dòng)(Grant, 1985)，包括基因從一個(gè)種群到另一種群成功運(yùn)動(dòng)的所有機(jī)制(Slatkni, 1985)。基因流可揭示群體間可能的基因滲透及影響遺傳分化的遺傳現(xiàn)象?；蛄髟酱?，群體間的相似性越大。固定系數(shù)與基因流之間的關(guān)系為Nm=1/(Fst+1)(Hmailton, 1999)。應(yīng)用DnaSP 5.0軟件(Librado & Rozas, 2009)計(jì)算各地理種群間的固定指數(shù)和基因流。

固定指數(shù)Fst和基因流Nm是表示種群遺傳分化程度的重要指標(biāo)。Fst值越大，表明遺傳分化越明顯，Nm值與之相反，Nm值越大說(shuō)明種群間基因交流越充分，遺傳分化越小。00.25，種群間分化明顯；Fst值為負(fù)數(shù)，表示2個(gè)種群之間沒(méi)有遺傳分化(Balloux & Lugon-Moulin, 2002)。Nm<1，說(shuō)明群體可能由于遺傳漂變而發(fā)生了分化；Nm>1，表明群體間的基因交流水平較高，群體間遺傳分化較小；Nm>4，種群間的基因交流更為充分，遺傳分化更小；Nm值為負(fù)數(shù)，表示2個(gè)種群間無(wú)基因交流(Allendorf, 1983; Millar & Libby, 1991)。

分子變異分析(analysis of molecular variance, AMOVA)是在分子水平上分析種群遺傳結(jié)構(gòu)的工具(Excoffieretal., 2005)，根據(jù)單倍型或基因型間的進(jìn)化距離(evolutionary distance)對(duì)各種群間的遺傳差異進(jìn)行等級(jí)劃分，AMOVA具有分子數(shù)據(jù)便于直接計(jì)算離差方的優(yōu)點(diǎn)，本研究應(yīng)用Arlequin 3.0軟件進(jìn)行分子變異分析(Excoffieretal., 2005)。

1.4.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 采用MEGA 4.0軟件按照Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算系統(tǒng)發(fā)育重建所需的遺傳距離(Kumaretal., 2008)，以鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)育樹(shù)分支的置信度采用自展法(bootstrap analysis, BP)重復(fù)檢測(cè)1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定及同源性分析

以每個(gè)地理種群的單頭西花薊馬DNA為模板，通用型引物L(fēng)CO1490/HCO2198進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，每個(gè)地理種群的西花薊馬均可擴(kuò)增出清晰的靶標(biāo)片段(長(zhǎng)度約為690 bp)(圖1)。對(duì)電泳檢測(cè)驗(yàn)證合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和序列測(cè)定，得到西花薊馬13個(gè)地理種群共計(jì)175條COⅠ基因序列。將所有序列采用ClustalX軟件比對(duì)，修剪成長(zhǎng)度為631 bp的標(biāo)準(zhǔn)片段進(jìn)行分析。利用NCBI中的BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示與數(shù)據(jù)庫(kù)中已公開(kāi)的西花薊馬COⅠ基因序列的同源性為99%～100%，表明所獲得的西花薊馬的COⅠ基因序列準(zhǔn)確可靠。

圖1 引物L(fēng)CO1490/HCO2198對(duì)不同地理種群西花薊馬COⅠ基因擴(kuò)增結(jié)果電泳檢測(cè)圖Fig.1 Amplification pattern of the COⅠ gene of F.occidentalis from 13 geographical populations using the universal primers LCO1490/HCO2198M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～13:西花薊馬不同地理種群，編號(hào)同表1; 14:陰性對(duì)照(超純水)。M: DNA ladder marker; 1～13: Different geographical populations, same as in table 1; 14: Negative control (ultra-pure water).

2.2 西花薊馬COⅠ基因序列變異分析

對(duì)西花薊馬不同地理種群共計(jì)175條COⅠ基因序列進(jìn)行變異分析(表2)，共檢測(cè)到596個(gè)保守位點(diǎn)，35個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)占序列總長(zhǎng)的5.55%，其中含有12個(gè)自裔位點(diǎn)，23個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。自裔位點(diǎn)分別位于第22、41、93、101、102、125、126、414、444、565、567和585位；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)分別位于第84、111、183、213、255、270、294、357、366、378、385、399、411、447、499、504、531、543、558、588、598、606和612位。所有序列的堿基平均含量分別為，A:31.1%,T:38.1%,C:14.5%,G:16.3%，A+T：69.2%。所有序列的總突變數(shù)(total number of mutations,η)為70，其中發(fā)生轉(zhuǎn)換的位點(diǎn)數(shù)為57，發(fā)生顛換的位點(diǎn)數(shù)為13，轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率為4.093(表2)。

2.3 單倍型分布及遺傳多樣性分析

在所檢測(cè)的西花薊馬13個(gè)地理種群175條序列中，共檢測(cè)到13種單倍型(haplotype, H)(H1～H13)。其中，H2為優(yōu)勢(shì)共享單倍型，在13個(gè)種群中均有分布，共享序列共計(jì)80條，占序列總數(shù)的45.7%；其次為單倍型H3，除河北石家莊SJZ和山東青島QD種群外，在其他11個(gè)種群中均有分布，占序列總數(shù)的30.3%；此外，河北石家莊SJZ、黑龍江哈爾濱HEB和寧夏銀川YC，共享單倍型H4，所占比例為8.6%；山西太原TY、山東青島QD和云南昆明KM，共享單倍型H6，所占比例為5.7%；另有9種單倍型，即H1,H5,H7,H8,H9,H10,H11,H12和H13，分別為北京豐臺(tái)FT、河北石家莊SJZ、吉林四平SP、黑龍江哈爾濱HEB、山東青島QD(H9,H10)、河南洛陽(yáng)LY、甘肅蘭州LZ和寧夏銀川YC等種群所特有(表3)。

表2 不同地理種群西花薊馬的mtDNA COⅠ基因序列變異分析Table 2 Results of mtDNA COⅠ gene sequences of F.occidentalis from different geographical populations

對(duì)單倍型多樣性Hd和核苷酸多樣性π進(jìn)行分析，結(jié)果表明，總體單倍型多樣性Hd0.691，不同地

理種群?jiǎn)伪缎投鄻有苑秶?.425～0.732，單倍型多樣性最高和最低的種群分別為黑龍江哈爾濱HEB(Hd=0.732)和甘肅蘭州LZ(Hd=0.425)；總體核苷酸多樣性π0.00652，不同地理種群核苷酸多樣性范圍0.00070～0.01594，核苷酸多樣度最高和最低的種群分別為寧夏銀川YC(π=0.01594)和云南昆明KM(π=0.00070)。對(duì)各種群?jiǎn)伪缎投鄻有訦d和核苷酸多樣性π進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明各種群在地域上存在明顯的種群多樣性差異，其中，寧夏銀川YC(Hd=0.689,π=0.01594)和黑龍江哈爾濱HEB種群(Hd=0.732,π=0.01506)具有較高的多態(tài)性，而內(nèi)蒙古包頭BT和陜西寶雞BJ種群(Hd=0.476,π=0.00075)的多態(tài)性較低(表4)。Tajima′s D中性進(jìn)化模型檢驗(yàn)結(jié)果顯示，除河北石家莊SJZ、黑龍江哈爾濱HEB和寧夏銀川YC 3個(gè)種群外，其他種群的Tajima′s D檢驗(yàn)結(jié)果均未達(dá)到顯著水平。該結(jié)果表明，除上述3個(gè)種群以外的其他種群的mtDNA COⅠ基因的進(jìn)化都遵循中性模型。

表3 各單倍型在不同地理種群西花薊馬中的分布Table 3 Haplotypes of mtDNA COⅠ gene in different geographical populations of F.occidentalis

FT:北京豐臺(tái); SJZ:石家莊; TY:太原; BT:包頭; SY:沈陽(yáng); SP:四平; HEB:哈爾濱; QD:青島; LY:洛陽(yáng); KM:昆明; BJ:寶雞; LZ:蘭州; YC:銀川。

FT: Fengtai, Beijing； SJZ: Shijiazhuang； TY: Taiyuan； BT: Baotou； SY: Shenyang； SP: Siping； HEB: Harbin； QD: Qingdao； LY: Luoyang； KM: Kunming； BJ: Baoji； LZ: Lanzhou； YC:Yinchuan.

2.4 遺傳分化及基因流分析

將所有種群作為一個(gè)整體進(jìn)行分析，其總體固定系數(shù)Fst0.24359，變異范圍-0.05604～0.55271?？傮w基因流Nm0.78，變異范圍-40.04～35.75(表5)。綜合分析顯示，我國(guó)西花薊馬各地理種群之間可能已發(fā)生一定的分化。其中，黑龍江哈爾濱HEB種群與北京豐臺(tái)FT、山西太原TY、內(nèi)蒙古包頭BT、遼寧沈陽(yáng)SY、吉林四平SP、山東青島QD、河南洛陽(yáng)LY、云南昆明KM、陜西寶雞BJ和甘肅蘭州LZ等10個(gè)種群之間可能存在明顯分化；寧夏銀川YC種群與北京豐臺(tái)FT、山西太原TY、內(nèi)蒙古包頭BT、遼寧沈陽(yáng)SY、吉林四平SP、山東青島QD、河南洛陽(yáng)LY、云南昆明KM、陜西寶雞BJ和甘肅蘭州LZ等10個(gè)種群之間可能存在明顯分化；北京豐臺(tái)FT種群與山西太原TY、黑龍江哈爾濱HEB、山東青島QD、云南昆明KM、陜西寶雞BJ、甘肅蘭州LZ和寧夏銀川YC等7個(gè)種群之間可能存在明顯分化，與河北石家莊SJZ種群之間存在中度分化；山東青島QD種群與北京豐臺(tái)FT、內(nèi)蒙古包頭BT、遼寧沈陽(yáng)SY、吉林四平SP、黑龍江哈爾濱HEB、河南洛陽(yáng)LY和寧夏銀川YC等7個(gè)種群之間可能存在明顯分化，與陜西寶雞BJ、云南昆明KM和甘肅蘭州LZ等3個(gè)種群之間可能發(fā)生了中度分化(表5)。

表4 西花薊馬不同地理種群COⅠ基因單倍型、核苷酸多樣性分析及中性檢驗(yàn)Table 4 Haplotype diversity, nucleotide diversity and Tajima′s D neutrality test of F.occidentalis from different geographic populations

**P<0.01. FT:北京豐臺(tái); SJZ:石家莊; TY:太原; BT:包頭; SY:沈陽(yáng); SP:四平; HEB:哈爾濱; QD:青島; LY:洛陽(yáng); KM:昆明; BJ:寶雞; LZ:蘭州; YC:銀川。

**P<0.01. FT: Fengtai, Beijing； SJZ: Shijiazhuang； TY: Taiyuan； BT: Baotou； SY: Shenyang； SP: Siping； HEB: Harbin； QD: Qingdao； LY: Luoyang； KM: Kunming； BJ: Baoji； LZ: Lanzhou； YC: Yinchuan.

表5 西花薊馬種群間固定指數(shù)Fst (下三角形)和基因流Nm (上三角形)Table 5 Genetic fixation index (Fst) (lower triangular) and gene flow (Nm) (upper triangular) between geographical populations of F.occidentalis

FT:北京豐臺(tái); SJZ:石家莊; TY:太原; BT:包頭; SY:沈陽(yáng); SP:四平; HEB:哈爾濱; QD:青島; LY:洛陽(yáng); KM:昆明; BJ:寶雞; LZ:蘭州; YC:銀川。

FT: Fengtai, Beijing； SJZ: Shijiazhuang； TY: Taiyuan； BT: Baotou； SY: Shenyang； SP: Siping； HEB: Harbin； QD: Qingdao； LY: Luoyang； KM: Kunming； BJ: Baoji； LZ: Lanzhou； YC: Yinchuan.

2.5 AMOVA分子變異分析

AMOVA分析結(jié)果顯示，不同種群間的變異占總體變異的12.4%，同一種群內(nèi)不同個(gè)體間變異占87.6%，表明引起種群總體變異的主要因素為種群內(nèi)個(gè)體間的變異(表6)。

表6 西花薊馬各地理種群 mtDNA COⅠ 基因序列間的分子變異分析Table 6 Analysis of molecular variance among different geographical populations of F.occidentalis

2.6 西花薊馬各地理種群的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.6.1 基于本研究的西花薊馬13個(gè)地理種群的系統(tǒng)進(jìn)化分析 采用鄰接法構(gòu)建我國(guó)西花薊馬各地理種群不同單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，13個(gè)單倍型并沒(méi)有按照地理分布形成明顯的分支格局，各單倍型分散在不同的地理種群中，沒(méi)有形成明顯的、系統(tǒng)的地理種群結(jié)構(gòu)(圖2)。整體顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分為明顯的兩大支。第一支：共享單倍型H2的地理種群和共享單倍型H5的地理種群聚在一起，13個(gè)地理種群都共享單倍型H2，其中河北石家莊SJZ種群還共享單倍型H5。此外，共享單倍型H1、H3、H7、H11和H12的地理種群聚在一起；其中，內(nèi)蒙古包頭BT、吉林四平SP、云南昆明KM、山西太原TY、寧夏銀川YC、河南洛陽(yáng)LY、北京豐臺(tái)FT、甘肅蘭州LZ、遼寧沈陽(yáng)SY、陜西寶雞BJ和黑龍江哈爾濱HEB等11個(gè)種群共享單倍型H3，北京豐臺(tái)FT種群共享單倍型H1，吉林四平SP種群共享單倍型H7，河南洛陽(yáng)LY種群共享單倍型H11，甘肅蘭州LZ種群共享單倍型H12。同時(shí)，共享單倍型H6、H9、H10的地理種群聚在一起；其中，山東青島QD、山西太原TY和云南昆明KM等種群共享單倍型H6，且山東青島QD種群還共享單倍型H9和H10(圖2)。第二支：共享單倍型H4、H8、H13的地理種群聚在一起，其中河北石家莊SJZ、寧夏銀川YC和黑龍江哈爾濱HEB等3個(gè)種群共享單倍型H4，黑龍江哈爾濱HEB種群還共享單倍型H8，寧夏銀川YC種群共享單倍型H13(圖2)。

2.6.2 結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)中已公開(kāi)的西花薊馬不同地理種群的系統(tǒng)進(jìn)化分析 基于本研究已獲得的我國(guó)西花薊馬各地理種群不同單倍型COⅠ基因序列，結(jié)合GenBank中已公開(kāi)的國(guó)內(nèi)外不同地理種群西花薊馬的高質(zhì)量COⅠ基因序列(片段大小為433～680 bp)(表7)[GenBank中已公開(kāi)的西花薊馬序列多為廣泛存在的溫室品系序列，只有新西蘭的6條序列(EF555794～EF555799)為羽扇豆品系序列](Rugman-Jonesetal., 2010)，共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；同時(shí)，進(jìn)行單倍型(表7)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。結(jié)果顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分成了明顯的兩大支(圖3)。

第一大支，包括4個(gè)分支。其中，第一分支：山西太原TY(H2,n=4)、甘肅蘭州LZ(H2,n=12)、吉林四平SP(H2,n=1)、山東青島QD(H2,n=14;H9,n=6)、北京豐臺(tái)FT(H2,n=4)、河南洛陽(yáng)LY(H2,n=4)、黑龍江哈爾濱HEB(H2,n=6)、寧夏銀川YC(H2,n=8)、云南昆明KM(H2,n=12)、陜西寶雞BJ(H2,n=5)、遼寧沈陽(yáng)SY(H2,n=2)、內(nèi)蒙古包頭BT(H2,n=2)和河北石家莊SJZ(H2,n=6;H5,n=1)等13個(gè)種群與GenBank中的北京Beijing(Beijing-2,n=3)和云南Yunnan(Yunnan-2,n=4;Yunnan-3,n=7)種群，以及國(guó)外的荷蘭Holland(Holland-5,n=3;Holland-3,n=8;Holland-6,n=3)、澳大利亞Australia(Australia-2,n=9)、美國(guó)加利福尼亞California(California-3,n=6)和堪薩斯Kansas(Kansas-2,n=6;Kansas-1,n=2)、新西蘭New Zealand(New Zealand-4,n=5)和日本Japan(Japan-1,n=7)等種群聚在一起(圖3)。第二分支：吉林四平SP(H3,n=3;H7,n=1)、黑龍江哈爾濱HEB(H3,n=7)、內(nèi)蒙古包頭BT(H3,n=5)、陜西寶雞BJ(H3,n=2)、山西太原TY(H3,n=2)、河南洛陽(yáng)LY(H3,n=3;H11,n=1)、甘肅蘭州LZ(H3,n=3;H12,n=1)、北京豐臺(tái)FT(H3,n=13;H1,n=3)、遼寧沈陽(yáng)SY(H3,n=3)、寧夏銀川YC(H3,n=3)和云南昆明KM(H3,n=9)等11個(gè)種群與GenBank中的北京Beijing(Beijing-4,n=4)和云南Yunnan種群(Yunnan-4,n=7)，以及國(guó)外的荷蘭Holland(Holland-2,n=1)、澳大利亞Australia(Australia-1,n=1)、美國(guó)加利福尼亞California(California-1,n=2)和肯尼亞Kenya(Kenya-1,n=1)等種群聚在一起(圖3)。第三分支：寧夏銀川YC(H4,n=1;H13,n=1)、黑龍江哈爾濱HEB(H4,n=8;H8,n=1)、河北石家莊SJZ(H4,n=1)等種群與GenBank中的北京Beijing(Beijing-1,n=1)和云南Yunnan(Yunnan-1,n=1)種群，以及國(guó)外的新西蘭New Zealand(New Zealand-2,n=1;New Zealand-3,n=5)和荷蘭Holland(Holland-4,n=1)等種群聚在一起(圖3)。第四分支：山東青島QD(H6,n=5;H10,n=2)、云南昆明KM(H6,n=4)和山西太原TY(H6,n=1)等種群與GenBank中的北京Beijing種群(Beijing-3,n=3)，以及國(guó)外的新西蘭New Zealand(New Zealand-1,n=1)、荷蘭Holland(Holland-1,n=1)、美國(guó)的加利福尼亞California(California-2,n=4)和紐約New York(New York-1,n=1;New York-2,n=2)及英國(guó)UK(UK-1,n=1)等種群聚在一起(圖3)。

圖2 鄰接法構(gòu)建的我國(guó)西花薊馬各地理種群不同單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Neighbor-joining tree based on the analysis of the 13 haplotypes of F.occidentalis from different geographical populations in China分支處上方數(shù)值表示重復(fù)1000次后的自展值 (>50%)； 標(biāo)尺示遺傳距離。BT:內(nèi)蒙古包頭； SP:吉林四平； KM:云南昆明； TY:山西太原； LY:河南洛陽(yáng)； YC:寧夏銀川； LZ:甘肅蘭州； BJ:陜西寶雞； HEB:黑龍江哈爾濱； SY:遼寧沈陽(yáng)； QD:山東青島； FT:北京豐臺(tái)； SJZ:河北石家莊。Numbers on branches are bootstraped values (>50%) under 1000 replicates， the scale bar represents genetic distance.BT: Baotou, Neimenggu; SP: Siping, Jilin; KM: Kunming, Yunnan; TY: Taiyuan, Shanxi; LY: Luoyang, Henan; YC: Yinchuan, Ningxia; LZ: Lanzhou, Gansu; BJ: Baoji, Shaanxi; HEB: Harbin, Heilongjiang; SY: Shenyang, Liaoning; QD: Qingdao, Shandong; FT: Fengtai, Beijing; SJZ: Shijiazhuang, Hebei.

第二大支，南非South Africa(South Africa-1,n=1;South Africa-2,n=2)和意大利Italy種群(Italy-1,n=1;Italy-2,n=1)聚在一起，但未包含本研究的任一種群(圖3)。

在國(guó)外的所有序列中，只有單倍型編號(hào)為New Zealand-2(GenBank登錄號(hào)：EF555799)和New Zealand-3(GenBank登錄號(hào)：EF555794～EF555798)的序列為新西蘭西花薊馬的羽扇豆品系序列(Rugman-Jonesetal., 2010)，其余為廣泛分布的溫室品系序列。聚類分析還顯示，寧夏銀川YC種群的2條序列(H4,n=1;H13,n=1)、黑龍江哈爾濱HEB種群的9條序列(H4,n=8;H8,n=1)、河北石家莊SJZ種群的1條序列(H4,n=1)以及GenBank中北京Beijing種群的1條序列(Beijing-1,n=1)和云南Yunnan種群的1條序列(Yunnan-1,n=1)，與新西蘭西花薊馬的羽扇豆品系序列(GenBank登錄號(hào)：EF555794～EF555799)聚在一起，表明我國(guó)的北京、云南以及寧夏銀川、黑龍江哈爾濱、河北石家莊等部分地區(qū)已存在一定數(shù)量的西花薊馬羽扇豆品系。此外，荷蘭的1條序列(Holland-4,n=1)也與新西蘭的羽扇豆品系序列聚在一起，表明荷蘭亦存在西花薊馬的羽扇豆品系(圖3)。本研究中13個(gè)地理種群的其余序列，均為溫室品系序列，其可能的入侵來(lái)源推測(cè)如下：河北石家莊SJZ種群的序列與荷蘭、澳大利亞、美國(guó)加利福尼亞、美國(guó)堪薩斯、新西蘭、日本等種群的序列聚在一起，推測(cè)該種群可能來(lái)源于上述6個(gè)國(guó)家或地區(qū)(圖4A)；北京豐臺(tái)FT、河南洛陽(yáng)LY、黑龍江哈爾濱HEB、遼寧沈陽(yáng)SY、吉林四平SP、寧夏銀川YC、陜西寶雞BJ、內(nèi)蒙古包頭BT、山西太原TY、甘肅蘭州LZ等10個(gè)種群的序列與荷蘭、澳大利亞、美國(guó)加利福尼亞、美國(guó)堪薩斯、新西蘭、日本、肯尼亞等種群的序列聚在一起，推測(cè)我國(guó)上述10個(gè)區(qū)域的西花薊馬可能來(lái)源于這7個(gè)國(guó)家或地區(qū)(圖4B)；山東青島QD種群的序列與荷蘭、澳大利亞、美國(guó)加利福尼亞、美國(guó)堪薩斯、新西蘭、日本、美國(guó)紐約、英國(guó)等種群的序列聚在一起，推測(cè)該種群可能來(lái)源于上述這8個(gè)國(guó)家或地區(qū)(圖4C)；云南昆明KM種群的序列與荷蘭、澳大利亞、美國(guó)加利福尼亞、美國(guó)堪薩斯、新西蘭、日本、肯尼亞、美國(guó)紐約、英國(guó)等種群的序列聚在一起，推測(cè)該種群可能來(lái)源于上述這9個(gè)國(guó)家或地區(qū)(圖4D)。此結(jié)果說(shuō)明，我國(guó)西花薊馬溫室品系的各地理種群存在多個(gè)入侵來(lái)源。

表7 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中西花薊馬不同地理種群高質(zhì)量COⅠ基因序列登錄號(hào)Table 7 Accession numbers of partial COⅠ gene sequences of different geographical populations of F.occidentalis from GenBank

圖3 鄰接法構(gòu)建的西花薊馬不同地理種群COⅠ基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Neighbor-joining tree based on analysis of COⅠ gene sequences of F.occidentalis from different geographical populations分支處上方數(shù)值表示重復(fù)1000次后的自展值(>50%)； 標(biāo)尺示遺傳距離。BT:內(nèi)蒙古包頭； SP:吉林四平； KM:云南昆明； TY:山西太原； LY:河南洛陽(yáng)； YC:寧夏銀川； LZ:甘肅蘭州； BJ:陜西寶雞； HEB:黑龍江哈爾濱； SY:遼寧沈陽(yáng)； QD:山東青島； FT:北京豐臺(tái)； SJZ:河北石家莊； Beijing:北京; Yunnan:云南; New Zealand:新西蘭; Australia:澳大利亞; Japan:日本; Holland:荷蘭; South Africa:南非; Italy:意大利; Kenya:肯尼亞; UK:英國(guó); California:加利福尼亞; Kansas:堪薩斯; New York:紐約。 Numbers on branches are bootstraped values (>50%) under 1000 replicates, the scale bar represents genetic distance.BT: Baotou, Neimenggu; SP: Siping, Jilin; KM: Kunming, Yunnan; TY: Taiyuan, Shanxi; LY: Luoyang, Henan; YC: Yinchuan, Ningxia; LZ: Lanzhou, Gansu; BJ: Baoji, Shaanxi; HEB: Harbin, Heilongjiang; SY: Shenyang, Liaoning; QD: Qingdao, Shandong; FT: Fengtai, Beijing; SJZ: Shijiazhuang, Hebei.

3 小結(jié)與討論

本研究利用mtDNA COⅠ基因序列分析我國(guó)西花薊馬的種群多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，并以此推測(cè)西花薊馬的來(lái)源和傳播擴(kuò)散途徑。研究涉及我國(guó)西花薊馬13個(gè)地理種群。研究結(jié)果顯示，無(wú)論是西花薊馬種群的覆蓋度還是每一種群的樣本數(shù)量，均符合研究物種種群遺傳關(guān)系分析的基本需求(Zhangetal., 2010)。

對(duì)西花薊馬13個(gè)地理種群共計(jì)175條COⅠ基因堿基序列進(jìn)行變異分析，共檢測(cè)到596個(gè)保守位點(diǎn)，35個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中自裔位點(diǎn)12個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)23個(gè)。所有序列中A+T含量為69.2%，表現(xiàn)出明顯的A/T堿基偏向性，與昆蟲(chóng)線粒體基因組的堿基組成特征基本一致(Simonetal., 1994)。Kinght & Mindell(1993)研究指出，轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率的臨界值為2，當(dāng)小于2時(shí)表明基因突變已達(dá)到飽和狀態(tài)，大于2時(shí)表明基因突變尚未達(dá)到飽和狀態(tài)。本研究中13個(gè)西花薊馬地理種群所有序列的總突變數(shù)η為70，發(fā)生轉(zhuǎn)換和顛換的位點(diǎn)數(shù)分別為57和13，轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率為4.093，說(shuō)明我國(guó)西花薊馬COⅠ基因堿基序列的突變尚未達(dá)到飽和狀態(tài)。

圖4 西花薊馬河北石家莊SJZ (A)、北京豐臺(tái)FT、河南洛陽(yáng)LY、黑龍江哈爾濱HEB、遼寧沈陽(yáng)SY、吉林四平SP、寧夏銀川YC、陜西寶雞BJ、內(nèi)蒙古包頭BT、山西太原TY、甘肅蘭州LZ (B)、山東青島QD (C)和云南昆明KM (D)等種群入侵來(lái)源地示意圖Fig.4 Diagram showing the sources of F.occidentalis of Shijiazhuang, Hebei (A), Fengtai, Beijing; Luoyang, Henan; Harbin, Heilongjiang; Shenyang, Liaoning; Siping, Jilin; Yinchuan, Ningxia; Baoji, Shaanxi; Baotou, Neimenggu; Taiyuan, Shanxi; and Lanzhou, Gansu (B), Qingdao, Shandong (C) and Kunming, Yunnan (D) populations綠色圓圈表示河北石家莊SJZ種群; CA:加利福尼亞； KS:堪薩斯； NY:紐約； UK:英國(guó)； NL:荷蘭； KE:肯尼亞； JP:日本； AU:澳大利亞； NZ: 新西蘭。Green circle indicates population Shijiazhuang, Hebei； CA: California; KS: Kansas; NY: New York; UK: United Kingdom; NL: Holland; KE: Kenya; JP: Japan; AU: Australia; NZ: New Zealand.

單倍型多樣性Hd和核苷酸多樣性π是衡量一個(gè)種群線粒體DNA遺傳多樣性的2個(gè)重要指標(biāo)。本研究對(duì)13個(gè)西花薊馬地理種群、175條COⅠ基因序列的單倍型多樣性和核苷酸多樣性的檢測(cè)結(jié)果顯示，13個(gè)地理種群共有13種單倍型。進(jìn)一步的綜合分析顯示，其總體單倍型多樣性較高，為0.691；但核苷酸多態(tài)性較低，僅為0.00652。其中，黑龍江哈爾濱HEB、寧夏銀川YC、云南昆明KM、山東青島QD、河南洛陽(yáng)LY、山西太原TY、遼寧沈陽(yáng)SY等種群均表現(xiàn)出較低的單倍型多樣性；而核苷酸多樣性較高的種群只有黑龍江哈爾濱HEB和寧夏銀川YC種群，從而可能會(huì)使這2個(gè)種群與我國(guó)目前發(fā)現(xiàn)的83%以上的種群發(fā)生遺傳分化。因此，我國(guó)西花薊馬可能是由一較小的有效種群迅速增長(zhǎng)而來(lái)，雖然通過(guò)變異積累了一定的單倍型多樣性，但卻尚未積累足夠的核苷酸序列多樣性(Avise, 1998)。

固定指數(shù)Fst和基因流Nm是衡量種群遺傳分化的重要指標(biāo)。本研究對(duì)西花薊馬13個(gè)地理種群總體以及各種群之間的固定指數(shù)Fst和基因流Nm的分析結(jié)果顯示，各地理種群間可能存在一定程度的分化，其中黑龍江哈爾濱HEB、寧夏銀川YC、北京豐臺(tái)FT、山東青島QD等種群與其他種群之間可能出現(xiàn)了明顯分化。而不同種群間出現(xiàn)遺傳分化的原因，一方面可能是由于不同的地理分布區(qū)域，其溫度、濕度、寄主植物等環(huán)境因素不同，進(jìn)而導(dǎo)致西花薊馬在適應(yīng)不同的環(huán)境條件過(guò)程中可能出現(xiàn)一定的遺傳分化；另一方面可能與西花薊馬的入侵來(lái)源地不同有關(guān)；而后者所起作用可能更為重要。

武曉云等(2009)以COⅠ基因通用型引物mtD-7.2F/mtD-9.2R擴(kuò)增北京、云南昆明、黑龍江哈爾濱等三地，共計(jì)29頭西花薊馬的COⅠ基因片段(長(zhǎng)度為433 bp，包含在本研究的650 bp靶標(biāo)序列之中，對(duì)齊位置約從200 bp開(kāi)始)，通過(guò)聚類分析顯示，上述三地的部分COⅠ基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已公開(kāi)的新西蘭西花薊馬的羽扇豆品系序列(EF555794～EF555799)聚在一起，表明上述三地的種群都存在一定數(shù)量的羽扇豆品系，其來(lái)源地可能是新西蘭。本研究以我國(guó)西花薊馬不同地理種群?jiǎn)伪缎托蛄泻蛧?guó)外不同地理種群?jiǎn)伪缎托蛄泄餐瑯?gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，聚類分析結(jié)果顯示，我國(guó)西花薊馬亦存在2個(gè)品系，即羽扇豆品系和溫室品系。我國(guó)的北京豐臺(tái)、云南昆明、寧夏銀川、黑龍江哈爾濱、河北石家莊種群中已存在一定數(shù)量的羽扇豆品系，上述區(qū)域的部分西花薊馬可能來(lái)源于新西蘭或荷蘭。而廣泛存在于我國(guó)的不同地理種群的西花薊馬溫室品系存在多個(gè)入侵來(lái)源地。

隨著國(guó)際貿(mào)易以及國(guó)內(nèi)地區(qū)之間水果、蔬菜、花卉及其種苗的調(diào)運(yùn)或展覽展示，可能導(dǎo)致同一地理種群的西花薊馬存在多個(gè)入侵來(lái)源，或同一來(lái)源的多次入侵，或多個(gè)來(lái)源的多次入侵。該研究結(jié)果對(duì)西花薊馬的有效阻截及其種群擴(kuò)張趨勢(shì)監(jiān)測(cè)意義重大。

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