肖海軍，鄒 超，陳俊暉，陳麗媛

(江西農業(yè)大學 昆蟲研究所，江西 南昌 330045)

昆蟲逃避不利環(huán)境條件有兩種基本策略:滯育(diapause)和遷飛(migration)，滯育性害蟲容易在本地猖獗危害，遷飛性害蟲則常造成異地突然暴發(fā)，進而都會給農業(yè)生產帶來災難性損失［1-2］。滯育是昆蟲生長、發(fā)育、繁殖的停滯狀態(tài)，對昆蟲滯育調控機制的解析，一方面有利于加深認識生物發(fā)育模式調控基礎，另一方面滯育生物學基礎研究也可為防治害蟲提供新技術，具有重要的理論價值和實踐意義，無論是害蟲的綜合治理還是益蟲的合理利用，均離不開對滯育調控機制的系統(tǒng)研究［3-4］。昆蟲滯育的環(huán)境調控和生理機制研究已有了深入理解［5-6］，有許多研究工作應用果蠅(Drosophila melanogaster)、家蠶(Bombyx mori)等模式昆蟲，圍繞昆蟲發(fā)育與滯育的環(huán)境調控，生理生態(tài)以及促前胸腺激素PTTH、滯育激素DH、性信息素合成激活合成肽PBAN、熱休克蛋白Hsps 等在滯育進程中的作用，這些領域相關研究理論框架已經(jīng)基本形成［7］。迄今，在昆蟲中僅極少數(shù)基因被證明直接參與了昆蟲滯育的調控。如研究證實棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)脂肪體與大腦之間的串擾調控了發(fā)育停滯，滯育受到血液傳播代謝產物三羥酸(TCA)和大腦中調控中心相互作用的調控［8］。然而，昆蟲滯育適應性進化的調控中誘導、維持、解除和滯育后發(fā)育各階段過程中激素、能量、呼吸、生殖代謝的調控基礎仍有許多值得關注和深入研究的科學問題［4，9-10］?；趍RNA 大規(guī)模測序的轉錄組研究能夠從整體水平研究基因功能、基因結構以及相關代謝途徑，從而有助于進一步揭示昆蟲滯育過程中能量、激素、呼吸等相關代謝通路中特異表達基因的種類、數(shù)量、表達水平。本文從滯育調控差異基因的研究角度，對差異基因的篩選方法的相關研究進行總結梳理，對相關基因的功能研究進展進行了概述，以期為滯育的調控機制研究提供思路和參考。

1 組學手段與昆蟲滯育調控研究

近年來，隨著黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)、家蠶(Bombyxmori)、意大利蜜蜂(Apis mellifera)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、3 種金小峰科寄生峰(Nasoniagiraulti、N.longicornis 和N.vitripennis)、豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)、君主斑蝶(Danaus plexippus)、印度跳蟻(Harpegnathos saltator)、佛羅里達弓背蟻(Camponotus floridanus)、小菜蛾(Plutellaxylostella)和東亞飛蝗(Locusta migratoria)等昆蟲全基因組陸續(xù)公布，昆蟲功能基因組研究正在世界范圍內掀起熱潮［11-12］。早期滯育調控機制的研究，基本都是選擇麻蠅，家蠶等模式昆蟲。近來年，國內外滯育研究人員逐漸認識到，選擇非模式昆蟲開展滯育調控分子機制研究，有可能發(fā)現(xiàn)一些在模式昆蟲中易于被忽略但十分關鍵的昆蟲滯育調控機制［9］。隨著測序技術的發(fā)展，利用組學手段(轉錄組學、基因組學、蛋白質組學)的原理和技術研究生物生命活動運程中內在的調控機制正成為生命科學的發(fā)展趨勢。組學技術的發(fā)展，從轉錄組學和蛋白質組學方面開展夏季滯育、冬季滯育和非滯育昆蟲的調控機制研究將有望得到進一步拓展。2011 年底《Cell》公布的典型遷飛型昆蟲君主斑蝶(Danaus plexippus)基因組，編碼16 866個基因，這為今后開展鱗翅目昆蟲滯育和遷飛適應性進化的研究提供了一個理想基因注釋參考模式［13］。

昆蟲滯育過程中許多基因的表達具有時空特異性，基因表達分析對于揭示基因功能、了解基因間相互關系，闡明昆蟲在逆境脅迫條件下的生理生化調控機制起著至關重要的作用。對昆蟲不同滯育類型、昆蟲滯育過程中的特定生理階段中特異表達相關基因進行篩選、鑒定和功能分析，是近年探索昆蟲滯育調控分子機制的熱點工作。生物體內基因組是遺傳信息的儲存體，mRNA(轉錄組)是基因表達的中間體，功能性蛋白質(蛋白質組)是基因功能的執(zhí)行體?；虮磉_，首先要轉錄出mRNA，再翻譯成蛋白質，而后控制生物代謝過程。轉錄組學(transcriptomics)作為一種宏觀的整體論方法改變了以往選定單個基因或少數(shù)幾個基因零敲碎打的研究模式，將昆蟲功能基因研究帶入了一個全新高速發(fā)展的時代［14-15］。目前用于研究差異表達基因的方法主要有差別顯示DDRT-PCR［16］、抑制消減雜交SSH［17-18］、構建全長cDNA文庫，大規(guī)模表達序列標簽EST、特制微列陣基因芯片Microarry［19］、RNA-Seq［15］等。

2 滯育調控差異基因的篩選方法

2.1 差異顯示反轉錄PCR

差異顯示反轉錄PCR(DDRT-PCR)具有操作簡單，實驗過程快速曾廣泛應用，其缺點是可重復性差，假陽性高，擴增產生的cDNA 片斷包含的差異表達基因信息量相對較少［20］。棉鈴蟲蛹滯育解除關聯(lián)基因的研究中，運用差異顯示PCR 方法對相關基因進行篩選，獲得了56 個具有差異的cDNA 片段，并且通過RT-PCR 進行驗證，發(fā)現(xiàn)3 個基因表達量下調，4 個基因表達量上調，7 個差異表達的基因中，F(xiàn)KBP12，esr16 和NADH dehydrogenase 1 alpha sub-complex subunit 6 這3 個基因和已知的功能基因基因有較高的同源性［16］。通過應用mRNA 差異顯示PCR 技術對捻轉血矛線蟲滯育期蟲體及同期正常發(fā)育的蟲體比較研究發(fā)現(xiàn)，篩選獲得了74 個滯育期差異表達的基因EST，同源性分析表明rps-30、T24F1.2等已被證明參與了秀麗隱桿線蟲的滯育形成［21］。

2.2 抑制消減雜交

在未知基因種類和序列的情況下，抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)是尋找翻譯水平和轉錄水平滯育差別表達基因的好方法［7］。應用消減雜交庫(SSH)揭示淡色庫蚊(Culex pipiens)多個在滯育不同階段特異表達的基因，如調控壓力反應、食物消化和代謝等的基因［17］。應用SSH和qRT-PCR 比較蟋蟀(Allonemobius socius)滯育胚胎與非滯育胚胎，發(fā)現(xiàn)8 個候選基因與滯育誘導關聯(lián)［23］。比較棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)滯育誘導階段注定滯育和非滯育蛹，應用正向和反向SSH 文庫分別獲得194 和115 條特異序列，并在mRNA 水平和蛋白水平對特異表達基因進行了驗證［23］。在關于蔥蠅(Delia antique)的研究中，應用正向和反向SSH 文庫，從冬季滯育蛹中和夏季滯育蛹中分別獲得89 條和120 條特異序列，并且通過半通量RT-PCR 的驗證:18 個基因在冬季的相關表達量和18 個基因在夏季的表達量相當［18］。利用SSH 研究食麻蠅(Sarcophaga crassipalpis)滯育轉錄組時發(fā)現(xiàn):在滯育表達階段用northern 雜交分離得到了97 個特異克隆(unique clones)，其中17 個基因上調，1 個基因下調，上調基因的包括了熱激蛋白基因，重金屬抗性基因，神經(jīng)肽，結構基因，調控因子等［24］。利用SSH 技術從白紋伊蚊(Aedes albopictus)溫帶種群成熟卵母細胞(第五階段)分離RNA，在SSH 文庫中或得了438條序列，其中有324 條非冗余序列被鑒定出來［25］。應用抑制性消減雜交技術，以梨小食心蟲(Grapholita molesta)滯育和非滯育幼蟲為材料，構建滯育與非滯育正、反向差減cDNA 文庫，從中篩選滯育相關基因，共獲得的128 個滯育特異和132 個非滯育特異的EST 序列。其中，滯育差異表達EST 42 條、非滯育差異表達EST 46 條，對差異表達EST 同源檢索后推測，其功能大部分與滯育或非滯育特性相關［26］。但SSH 容易造成信息的缺失及形成非酶切位點區(qū)域內的點突變，小缺失與插入不容易被檢測，酶切位點少的基因組則無法用SSH 篩選。

2.3 構建全長cDNA 文庫

1970 年，構建cDNA 文庫已經(jīng)成為一個研究基因組學的手段。而構建全長cDNA 文庫克服了傳統(tǒng)cDNA 文庫的缺點，大大地減少了基因克隆和功能鑒定的時間。目前運用最多的構建全長cDNA 文庫的方法是SMART 法和CAP-trapper 法，SMART 法運用于構建一般質量的cDNA 文庫，而CAP-trapper法更傾向于構建高質量的cDNA 文庫［27］。研究利用SMART 構建棉鈴蟲幼蟲唾液腺全長cDNA 文庫，為篩選棉鈴蟲于寄主互作信號因子提供基因信息資源［28］。采用SMART 技術合成蔥蠅(D.antique)非滯育蛹全長cDNA，將限制性內切酶Sfil 消化后的cDNA 克隆到質粒載體pDNR-LIB，轉化入大腸桿菌(DH10B)，獲得蔥蠅非滯育蛹原始文庫，獲得庫容量為2.3×107個單克隆;隨機挑取15 個單克隆，通過PCR 快速鑒定，插入片段大小在0.4～1.2 kb，平均大小在0.9 kb，重組率達100%，構建文庫的代表性和重組片段的序列完整性有利于基因的分離篩選［29］。應用同樣的方法方法分別構建了高質量蔥蠅夏滯育和冬滯育的全長cDNA 文庫［30-31］。研究成功構建了木乍蠶(Antheraeapernyi)全長cDNA 文庫，從一個新生的雌性蛹的滯育階段提取全部的RNA，所或得的文庫濃度為5×105 cfu/mL，重組率接近95%。從250 個有效的序列中形成了175 個ESTs，其中包含了24 個重疊群(contigs)和151 單克隆(singlets)，23.4%是新ESTs，其中得到ApKK42-BP 基因，在滯育階段是高表達，可能涉及到蛹滯育解除［32］。

2.4 基因表達序列標簽

基因表達序列標簽(EST)曾廣泛應用于新基因發(fā)現(xiàn)，基因表達分析和蛋白質組學，但ESTs 序列通常很短，沒有給出完整的表達序列;且低豐度表達基因不易獲得。由于EST 是單次測序結果，序列大約2%錯誤［19］。麻蠅(S.crassipalpis)不同發(fā)育階段的EST 轉錄組，共獲得207 110個EST 序列，平均長度241 bp，所有的reads 組合成20 995個重復片斷和31 056個單一序列，比對NR 和NT 數(shù)據(jù)庫，鑒定出11 757個特異基因，這為進一步研究滯育特性、脅迫反應、生殖和免疫提供了一個優(yōu)秀的研究平臺［33］。剛進入滯育與非滯育比較有368 個基因下調(＞2 倍)，336 個基因上調(＞2 倍)，且不同滯育階段差異表達基因群和上、下調表達的程度明顯不同［34］。

2.5 基因芯片技術

基因芯片技術(microarry)分析生物轉錄組具有高組分、高通量特點?；诙ㄖ频拿纱蠹{果蠅(Drosophila montana)基因芯片，發(fā)現(xiàn)101 個與滯育特性、光周期性、繁殖行為、光周期鐘和逆境脅迫等關聯(lián)的候選基因，這為進一步研究蒙大納果蠅成蟲適應北緯地區(qū)光周期季節(jié)性變換的生殖滯育研究奠定基礎;挑選芯片上24 個基因進行了滯育雌蟲、繁殖雌蟲和幼年雌蟲的表達譜分析，發(fā)現(xiàn)滯育雌蟲與繁殖成蟲比較僅Dca(Drosophila cold acclimation gene)基因上調表達，15 個下調表達基因中7 個明顯與不同滯育階段關聯(lián)，5 個與年齡相關［35］。在芯片表達譜的基礎上，挑選與蒙大納果蠅滯育特性關聯(lián)的cpo 基因(couch potato gene)進行qRT-PCR 驗證表明:與繁殖個體比較，滯育個體cpo 基因明顯上調表達［35］。在黑腹果蠅(D.melanogaster)中cpo 基因在胰島素信號通路和卵黃原蛋白合成的下游調控中起重要作用，進一步研究表明cpo 基因也在滯育調控中起重要作用［20，36］。淡色庫蚊(C.pipiens)的cpo 基因在成蟲羽化之前，滯育與非滯育個體cpo 基因表達無差異，7 天后滯育成蟲cpo 基因明顯上調表達［37］。蘋果實蠅(Rhagoletis pomonella)滯育解除前后基因芯片表達譜，解析了滯育解除前后Wnt 和TOR 信號通路途徑的關鍵基因表達差異［38］。Cabrera 等［39］應用基因芯片首次比較了智利小植綏螨(Phytoseiulus persimilis)滯育與非滯育成蟲轉錄組差異。由于基因芯片無法同時大量地分析組織或細胞內基因組表達的狀況，且芯片技術需要準備特異基因探針，所以有可能漏掉那些未知的、表達豐度不高的、可能是很重要的調節(jié)基因［40］。

2.6 RNA 轉錄組測序

高通量測序技術的出現(xiàn)，基于mRNA 大規(guī)模測序的RNA-Seq 已成為轉錄組學研究差異表達基因的主要手段［41-42］?；诟咄繙y序的RNA-Seq 技術可檢測不同狀態(tài)下基因mRNA 表達，研究細胞在某一功能狀態(tài)下含mRNA 的類型與拷貝數(shù);搜尋與功能狀態(tài)變化緊密相關的重要基因群，因此可以用來篩選控制生物特定性狀的目的基因和推斷相應未知基因的功能，在整體水平解析基因功能以及基因結構，揭示特定生物學過程的分子機理［43-45］。基于Illumina 或454 高通量測序平臺的轉錄組測序能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，具有定量更準確、可重復性更高、檢測范圍更廣、分析更可靠等特點。除分析轉錄本的結構和表達水平，RNA-Seq 還能發(fā)現(xiàn)未知和稀有的轉錄本、編碼序列單核苷酸多態(tài)性(SNP)、剪接變體，并提供等位基因特異的基因表達［37，41，46］。

RNA-Seq 檢測樣品總的RNA，但細胞中很大一部分RNA 都來自核糖體和線粒體，這就相對限制了其他RNA 的讀取數(shù)量以及這些RNA 表達水平的準確性。針對RNA-Seq 此缺陷，polyA RNA 選擇和核糖體RNA 去除可應用來解決這個問題。這兩種方法中，核糖體RNA 去除技術是更經(jīng)濟而有效的方法［46］。相對于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺，RNA-Seq 轉錄組測序無需設計探針，即可對任意物種的整體轉錄組進行檢測，提供更精確的數(shù)字化信號，具有更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉錄組復雜性的強大工具［37，46-48］。

由于測序技術的發(fā)展，目前NCBI 的UniGene 數(shù)據(jù)庫已經(jīng)收集了140 個物種共2 691 966 條序列，其中包含14 種昆蟲的轉錄組數(shù)據(jù)。其中，除豌豆蚜(A.pisum)和棉蚜(A.gossypii)，缺少其它農業(yè)害蟲的轉錄組數(shù)據(jù)［49］。利用RNA-Seq、Tiling microarray 和cDNA 測序獲得了30 個不同發(fā)育階段的果蠅轉錄組，共鑒定了111，195 個新的功能元件，包括數(shù)千個基因，蛋白編碼基因、非編碼基因的轉錄本、選擇性剪接和RNA 編輯等［50］。在用RNA-Seq 研究白紋伊蚊(A.albopictus)滯育準備期的過程中，運用高通量表達基因分析揭示了滯育準備中內分泌信號、細胞增殖、新陳代謝、能量的產生、微孔結構的主要變化［51］。通過白紋伊蚊(A.albopictus)全基因表達分析，發(fā)現(xiàn)滯育階段早期大量涉及到代謝的基因差異表達，到后期的差異表達逐漸減少，僅脂肪代謝基因的表達在滯育后期是差異顯著［52］。

3 蛋白質組學研究

蛋白質組學是在大規(guī)模水平上研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識［53］。結合二維微分凝膠電泳和質譜分析法分析翼蚜外繭蜂(Praonvolucre)滯育型和非滯育型代謝和基因表達不同時發(fā)現(xiàn)一系列蛋白質和結構功能發(fā)生了改變［54］。在分析草地螟滯育與非滯育幼蟲之間的蛋白質差異時利用雙向電泳和質譜技術發(fā)現(xiàn):ATP 合酶β 亞基、肌球蛋白重鏈，微管蛋白β-1 鏈等五個基因僅存在非滯育幼蟲中，肌肉肌球蛋白重鏈僅存在滯育幼蟲中［55］。在對亞洲玉米螟越冬滯育研究中發(fā)現(xiàn)，53 個差異蛋白點(表達豐度3 倍以上)中43 個上調表達，7 個下調表達，1 個蛋白點消失，通過MALDI-TOF/TOF 質譜分析法鑒定，成功鑒定11 個蛋白點［56］。運用雙向電泳技術，在棉鈴蟲即將滯育幼蟲體中，有37 個蛋白質差異表達，通過MALDI-TOF/TOF 質譜分析法鑒定，成功鑒定28 個差異表達基因［57］。運用相同的技術和方法研究非滯育和注定滯育的蛹的大腦，總共有79 個蛋白質和23 個磷酸蛋白質時存在差異表達的，其中有41 個蛋白質和10 個磷酸蛋白質被成功鑒定［58］。運用蛋白質組學研究小麥吸漿蟲各個生長時期(滯育前、越夏滯育、越冬滯育和滯育后)，運用雙向電泳技術檢測到300 個蛋白點，其中275 個蛋白點在其它的時期都是存在的。越夏滯育、越冬滯育和滯育后期與預滯育相比較，表達豐度在兩倍以上的蛋白點分別是91、92 和95 個;這其中，有8 個蛋白點在幼蟲的不同時期表達有明顯差異，運用MALDI-TOF/TOF 質譜分析法分析:7 個蛋白點被成功得鑒定出來［59］。

4 滯育關聯(lián)基因的功能驗證

RNA 干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象是指內源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導的細胞內相應序列mRNA 發(fā)生特異性降解，導致靶基因的表達沉默，產生相應基因的功能表型缺失［60］。研究已經(jīng)證實昆蟲體內存在基因沉默現(xiàn)象，通過注射和喂食dsRNA 可抑制靶標基因的表達。生物學相關重要基因表達的抑制，可影響昆蟲正常生長發(fā)育，甚至產生致死作用，這為研究昆蟲基因功能和開發(fā)害蟲防治新方法開辟了一條新的途徑［61］。目前對昆蟲進行RNAi 的操作技術已經(jīng)比較成熟，將dsRNA 或siRNA導入昆蟲體內主要有注射、飼喂和組織培養(yǎng)3 種方法。RNAi 技術已廣泛應用于昆蟲生殖、胚胎發(fā)育、生物合成和行為等方面研究［61］。將dsRNA 導入到淡色庫蚊(C.pipiens)幼蟲體內來檢驗蚊子脫水的耐性，幼蟲先在NaCl 鹽水溶液中脫水，再在含有dsRNA 的水溶液中再水化，成功地抑制了熱激蛋白Hsp90的表達［62］。在滯育生物學相關領域，應用RNAi 技術抑制麻蠅(S.crassipalpis)Hsp23 和Hsp70 的表達，并未改變其是否進行滯育和滯育期長短，但明顯影響低溫條件下存活率［63］。應用RNAi 對始紅蝽(Riptortuspedestris)光周期鐘基因負調控period 基因和正調控cycle 基因進行干涉，可明顯破壞破壞其原有節(jié)律。干涉period 導致在成蟲在滯育誘導的光周期條件下不進入滯育而繼續(xù)發(fā)育，干涉cycle 則誘導成蟲在滯育抑制的長光照條件下進入滯育［64］。應用RNAi 技術對始紅蝽(R.pedestris)的生物鐘Clock 基因進行干擾，影響了昆蟲內表皮極化和非極化的交替沉積，并且改變了卵巢發(fā)育規(guī)律，這表明Clock 基因涉及到光周期響應［65］。運用RNAi 技術，生物鐘與光周期誘導滯育之間的聯(lián)系得到了確定［66］。

5 滯育差異基因的研究展望

目前，昆蟲滯育調控分子機制研究領域，多數(shù)是基于家蠶、果蠅、麻蠅、淡色庫蚊等模式昆蟲，主要包括從昆蟲滯育過程中特定滯育生理階段搜索相關的差異表達基因［18，36］或是滯育相關蛋白［18，54，58］;分析、比較了特定基因在滯育進程中、滯育維持與滯育解除階段、滯育與非滯育型個體中的表達動態(tài)［37］;對一些分離到的特定滯育相關基因(如hsp)進行功能鑒定表明，一些滯育誘導的差異表達基因與滯育調控并無直接相關，但影響滯育期間昆蟲的抗逆性［63］。少部分滯育相關基因被認為可能參與了滯育發(fā)育調控，如淡色庫蚊(C.pipiens)生殖滯育中滯育相關基因的鑒定及功能分析表明，脂肪積累相關基因fas-1、fas-3 和fabp、胰島素受體基因、ILP-1(insulin-like peptides-1)基因、核糖體蛋白基因rpS2 和rpS3a［4，10，18］。但由于昆蟲滯育相關基因篩選范圍大，模式昆蟲的研究有時并不能完全反映重要農業(yè)昆蟲復雜生物學現(xiàn)象。同時，選擇非模式農業(yè)昆蟲開展滯育調控分子機制研究，有可能發(fā)現(xiàn)一些在模式昆蟲中易于被忽略但十分關鍵的昆蟲滯育調控機制，而且非模式昆蟲的研究成果有望直接應用于農業(yè)生產實踐中病蟲害的防治［10-11，67］。后基因組時代的到來，昆蟲功能基因組的研究重心將過渡到基因功能研究，因此，應用RNAi、蛋白質組學、功能基因組學等手段研究調控昆蟲滯育等生物學過程的關鍵基因和蛋白的功能有望獲得新的突破。同時，隨著測序技術發(fā)展，生命科學技術的巨大變革將進一步推動后基因組時代生物信息技術的發(fā)展，以促進人們破譯基因組所蘊涵的功能信息，詮釋生命進化的奧秘。

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