腦膠質細胞瘤簡稱為膠質瘤 (Gliomas)，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，總體發(fā)病率高，約為12/10萬，居顱內(nèi)腫瘤第一位，約占成人原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的60%［1］，國內(nèi)報道總的發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤的35.26%～60.96%，平均為44.69%［2］腦膠質細胞瘤可發(fā)生于任何年齡段，其生長速度快，侵襲性和轉移性強，預后差，其治療原則是手術切除，后雖輔以放、化療，但復發(fā)率仍高，常常在短期內(nèi)復發(fā)，是神經(jīng)外科研究領域難點和醫(yī)學研究的重要課題之一。本研究應用免疫組織化學方法檢測正常腦組織和原發(fā)、復發(fā)膠質瘤中HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67四種因子的表達情況，并探討其與膠質瘤復發(fā)之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組資料對照組為正常腦組織10例，取自顱腦外傷患者內(nèi)減壓或腦出血減壓術的非腫瘤患者，并將他們制備成蠟塊。實驗組為2007年2月至2011年11月濰坊市人民醫(yī)院神經(jīng)外科收集的同一患者經(jīng)手術切除并經(jīng)病理科證實的原發(fā)、復發(fā)腦膠質瘤30例，其中男19例，女11例，平均年齡47.9歲。取每一位患者2次術后石蠟病理蠟塊共計60塊。并按照2000年WHO制定神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準確定60塊病理蠟塊的分類和分級:I級5塊，Ⅱ級19塊，Ⅲ級21例，Ⅳ級15例。為方便統(tǒng)計，將I級和Ⅱ級歸為低度惡性組，將Ⅲ級和Ⅳ級歸為高度惡性組。

1.2 實驗材料 鼠抗人 HIF－1α單克隆抗體，兔抗人VEGF多克隆抗體，兔抗人MMP－9多克隆抗體，兔抗人Ki－67單克隆抗體，通用型PV－6000二步法免疫組化試劑盒，S－P法免疫組織化學染色試劑盒和DAB顯色試劑盒，除HIF－1α購自北京博奧森生物技術有限公司，其余試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色 全部10例對照組標本和全部60塊標本經(jīng)甲醛固定和石蠟包埋后，進行HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67因子的表達檢測，所有蠟塊行連續(xù)切片6張，層厚4μm，其中1張行蘇木精－伊紅 (HE)染色確定病理診斷，1張備用，其余4張采用S－P免疫組織化學染色法檢測HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67的表達情況，嚴格按照說明書規(guī)范操作。

1.4 結果判定

1.4.1 定性判定方法 陰性對照:用PBS代替一抗作陰性對照，結果為陰性;陽性對照:用北京博奧森生物技術有限公司和北京中杉金橋生物技術有限公司提供的陽性標本作為陽性對照。陽性結果:陽性結果鏡下為棕褐色或棕黃色，HIF－1α為細胞核和 (或)細胞漿著色，VEGF，MMP－9，Ki－67為細胞漿著色。

1.4.2 定量判定方法 染色結果判定:采取半定量計數(shù)法進行評判，根據(jù)染色強度分為四個等級:陰性為0分;弱陽性 (淡黃色)為1分;陽性 (黃色)為2分;強陽性(棕黃色)為3分;根據(jù)陽性細胞數(shù)占總視野細胞數(shù)的百分比進行分級:＜5%認為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，50%以上為3分。2個分值相加0分為 (－)，1～2分者為弱陽性 (+)，3～4分者為陽性 (++)，5～6分者為強陽性 (+++)。

1.5 統(tǒng)計學分析 所有試驗數(shù)據(jù)由SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，根據(jù)實驗資料，應用配對資料的符號秩和檢驗對膠質瘤復發(fā)前后的病理級別進行比較;應用配對t檢驗，對原發(fā)和復發(fā)膠質瘤中 HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67的表達情況分別進行比較;應用Fisher's確切概率法對正常腦組織和膠質瘤之間的HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67的表達進行比較;應用兩獨立樣本t檢驗對所有膠質瘤各個級別膠質瘤之間HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67的表達進行比較;應用spearman等級相關分析驗證HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67之間的相關性;應用spearman等級相關分析驗證膠質瘤復發(fā)時間和原發(fā)膠質瘤病理級別、HIF－1α表達強度、VEGF表達強度，MMP－9表達強度，Ki－67表達強度之間的相關性;以P＜0.05認為結果有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

在10例正常腦組織中均未見 HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67的表達，60例膠質瘤中HIF－1α表達41例，表達率68.33%;VEGF表達39例，表達率65.00%;MMP－9表達47例，表達率78.33%;Ki－67表達45例，表達率75.00%，HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67在膠質瘤中的表達強度與正常腦組織之間以及低度惡性組和高度惡性組之間均具有統(tǒng)計學差異P＜0.05。膠質瘤復發(fā)后有21例病人病理級別增強，6例不變，3例下降，經(jīng)配對資料的符號秩和檢驗P＜0.05，認為膠質瘤復發(fā)后病理級別增加。經(jīng)配對t檢驗說明HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67在膠質瘤復發(fā)組中的表達高于原發(fā)組，且兩組之間有差別有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)，說明復發(fā)后侵襲性得到增強。經(jīng)spearman等級相關分析HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67四者之間兩兩相關 (P＜0.05)，但膠質瘤復發(fā)時間跟原發(fā)膠質瘤病理級別、HIF－1α表達強度、VEGF表達強度，MMP－9表達強度，Ki－67表達強度之間均無統(tǒng)計學意義。

3 討 論

膠質瘤作為一種惡性腫瘤，它有三種主要的生理特性過程;增生/增殖、血管新生、侵襲［3］。膠質瘤復發(fā)的定義為原發(fā)性膠質瘤術后以及其它治療后腫瘤再次生長，且復發(fā)膠質瘤的部位比較局限，國外學者認為80%以上的復發(fā)性膠質瘤出現(xiàn)在原發(fā)灶周圍2 cm范圍，這可能與膠質瘤的生物學特征有關［4］。盡管絕大多數(shù)膠質瘤都可以選擇手術治療，盡量完全切除瘤體，但腫瘤呈侵潤性生長，可侵入到正常腦組織，無論在肉眼和顯微鏡下腫瘤都難以徹底切除，說明手術完全切除是不可能的，術后雖結合放化療，雖然很少轉移至其他器官，但多數(shù)患者仍復發(fā)或進展，侵潤到周邊鄰近組織的殘留腫瘤細胞成為復發(fā)根源，腫瘤復發(fā)成為一種常見。由于膠質瘤這種特性，臨床上治療這類疾病目前還無法根治，目前仍主要依賴手術聯(lián)合放、化療，采取綜合治療，但預后不佳，易復發(fā)，但膠質瘤復發(fā)時間的長短不一，主要認為膠質瘤細胞自身的生物學特性是腫瘤復發(fā)的關鍵，而腫瘤患者的年齡、性別、精神情緒、營養(yǎng)狀況及膠質瘤的部位和大小跟膠質瘤的復發(fā)尚無明確定論。這一切生物學特性導致其成為神經(jīng)外科研究領域難點和醫(yī)學研究的重要課題之一。

近10余年來隨著分子生物學技術的發(fā)展特別是腫瘤分子生物學平的快速提高，越來越多的國內(nèi)外學者再次開始仔細研究膠質瘤細胞發(fā)生、發(fā)展以及復發(fā)的分子生物學特性和機制，特別是膠質瘤細胞的缺氧環(huán)境適應、缺氧狀態(tài)應激和調(diào)節(jié)，細胞凋亡 (apoptosis)、增殖失控、原癌基因和抑癌基因的激活與失活以及細胞外基質 (Extracellular matrix)的降解都參與了膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展和復發(fā)，也逐漸認識到膠質瘤的發(fā)生和復發(fā)在分子和基因水平的研究是一個多因素、多基因參與的多步驟的復雜過程，并重新成為膠質瘤研究重點，并有望成為膠質瘤治療和預防或延緩膠質瘤復發(fā)的新靶點。目前認為膠質瘤的侵襲和復發(fā)受多種基因、蛋白以及細胞因子的調(diào)控，其中以缺氧壞死因子(HIF－1α)、血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)、基質金屬蛋白酶9(MMP－9)、核增殖抗原表達基因 (Ki－67)為典型。

缺氧誘導因子 (Hypoxia inducible factor－1 HIF－1α)是 Semenza GL，Agani F，Booth G［5］等學者在 1992 年首次在缺氧誘導細胞的提取物中發(fā)現(xiàn)的一種在缺氧條件下與促紅細胞生成素 (erythropoietin，EPO)基因3'增強子特異性結合的蛋白質。HIF－1由HIF－1α和HIF－1β2個亞基組成，2種亞基具有缺氧誘導因子的許多共同特征，但HIF－1α比HIF－1β更起關鍵作用，是主要的調(diào)節(jié)亞基和功能亞基單位，它決定著HIF－1的活性。在人類多種惡性腫瘤細胞中高表達，對腫瘤的增殖、血管的生成、能量代謝、紅細胞生成、細胞凋亡和預后皆有重要作用。惡性腫瘤細胞的快速生長，使其處于缺氧和營養(yǎng)缺乏環(huán)境中，而腫瘤長期處于缺氧狀態(tài)，可誘導HIF－1α因子的釋放，從而在腫瘤細胞中高表達。HIF－1在原發(fā)性膠質瘤中的表達隨病理級別的增高而增高［6］，但對于復發(fā)膠質瘤還沒有深入研究，僅有學者有提出HIF－1有激發(fā)膠質瘤發(fā)展及復發(fā)的作用。本研究結果表明在10例正常腦組織中HIF－1α因子中無陽性表達，HIF－1α因子在腦膠質瘤中呈陽性表達，并且隨著腫瘤惡性程度的增加，陽性表達率升高，在高度惡性組與低度惡性組中表達有顯著差異，同時本研究說明HIF－1α因子在復發(fā)膠質瘤組中的陽性表達高于原發(fā)組。這提示在高度惡性的腦膠質瘤細胞相比低度惡性的缺氧更加明顯，復發(fā)后膠質瘤細胞缺氧比原發(fā)組更加顯著。這都充分說明缺氧是引起HIF－1α表達增強的重要機制［7］，膠質瘤的快速復發(fā)同樣說明復發(fā)時腫瘤細胞快速增值，缺氧更加明顯。同時說明抑制HIF－1α的表達，可以抑制膠質瘤細胞的侵襲和延緩復發(fā)能力，目前HIF－1α在腫瘤中的高表達已使其成為抗腫瘤藥物研究中新的研究靶點，這種與膠質瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關的生物學特征可作為膠質瘤基因治療的新途徑，可以通過抑制HIF－1作為治療膠質瘤和阻止復發(fā)的靶點，并可作為膠質瘤放療的敏感指標［8］。

另外膠質瘤的血管形成在腫瘤的生長和浸潤中也起著重要作用，膠質瘤的侵襲性生長是一個多因素、多步驟的復雜過程，這其中包括被大家熟知的血管內(nèi)皮細胞生長因子 (Vascular endothelial growth factor，VEGF)家族，VEGF是由Ferrara等學者在1989年首先純化分離出來的一種肝素結合因子。VEGF是一種二聚體糖蛋白，分子量為45 KD，基因位于6p21.3上，基因組長14 kb，其中包含8個外顯子和7個內(nèi)含子。VEGF是新生血管形成的中心調(diào)控因子，其主要功能包括 (1)由于腫瘤細胞在快速生長過程中對氧和營養(yǎng)的需求量過大，而缺氧恰為VEGF最強烈的誘導劑，因而導致VEGF大量分泌，加速血管內(nèi)皮細胞的增生和分化，促使新生血管生成;(2)VEGF可激活血管內(nèi)皮細胞基因，增強尿激酶型纖溶酶原激活物 (uPA)和組織型纖溶酶原激活物 (tP－A)，并減弱纖溶酶原激活劑抑制物(PAI－1)的表達，進而誘導蛋白水解酶、間質膠原酶和組織因子的產(chǎn)生來促進血管的形成［9］;(3)VEGF促使血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生MMP－9，使凝血酶原轉化為凝血酶，激活明膠酶原A降解原來的基膜，促使血管形成［10］;(4)VEGF可通過細胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)蛋白及磷酸肌醉途徑增強NO合酶(NOS)表達，導致NO生成增多，進而促進新生血管網(wǎng)建立和管腔的形成。所有這些都提示VEGF與膠質瘤的發(fā)展、轉移、診斷、復發(fā)及預后有的密切的關系。

基質金屬蛋白酶9(MMP－9)是基質金屬蛋白酶家族中較為重要的一種，而一種130千道爾頓的MMP－9被認為是可以合成其它形式的蛋白酶，MMP－9不僅在膠質瘤的侵襲性中有重要貢獻，在血管生成中也參與其中，同時也參與退化血腦屏障和神經(jīng)細胞［11］。MMP－9在膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，且隨著膠質瘤惡性程度的增加，其病理級別也隨之增加，在MMP－9的表達中，MMP－9的表達強度與膠質瘤惡性程度正相關，即膠質瘤的惡性程度越高其MMP－9的表達強度越強［12］。而在膠質瘤復發(fā)中，MMP－9同樣起著重要作用，在膠質瘤復發(fā)后MMP－9表達得到進一步增強［13］在體外試驗研究中，也表明在惡性神經(jīng)膠質細胞瘤復發(fā)過程中，MMP－9起著非常重要的作用，MMP－9在復發(fā)膠質瘤患者的腦脊液檢測中，其水平可明顯升高，且用強力霉素這種特異性的MMPs抑制劑可阻斷MMMPs中MMP－2和 MMP－9的活性［14］，此外這預示MMP－9可以預示膠質瘤的早期進展，它可以作為膠質瘤進展的一個標記。Ki－67是一種存在于增殖細胞核的非組蛋白性核蛋白，由345kd和395kd兩條多肽鏈組成，其半衰期短，Ki－67表達同細胞周期密切相關，更能反映腫瘤的增殖活性，在正常腦組織中幾乎不表達，而在膠質瘤中表達，且是目前增殖活動研究中非?？煽康卦鲋硺酥?，也是目前應用最廣泛的增殖細胞標志之一［15］。其中MMP－9和Ki－67在腫瘤細胞的增殖和分化中起著重要作用，是表達腫瘤侵襲性和侵潤性的良好指標，其表達也一起與腫瘤的復發(fā)有關。

本課題研究的30例患者平均復發(fā)時間為17.7個月，最短復發(fā)時間為2.0個月，最長復發(fā)時間為39.7個月，將復發(fā)時間數(shù)據(jù)跟原發(fā)膠質瘤病理級別、HIF－1α表達強度、VEGF表達強度，MMP－9表達強度，Ki－67表達強度之間經(jīng)統(tǒng)計學處理，得出復發(fā)時間跟五者之間均無統(tǒng)計學意義。但本實驗HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－6四種細胞因子經(jīng)spearman等級相關分析，表明兩兩之間存在相關性，四種因子在復發(fā)膠質瘤中的表達明顯比原發(fā)膠質瘤中的表達強度增加，且統(tǒng)計學有意義;說明四者在膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展、增值和復發(fā)過程中起著重要作用，其中MMP－9啟動子的活性是由HIF－1α調(diào)控［16］，HIF－1α是在缺氧條件下穩(wěn)定和刺激MMP－9的表達，更能誘導MMP－9基因在腫瘤中侵襲，從而影響腫瘤的侵潤，進來研究中HIF－1α作用機制中已明確其能增加MMPs如MMP－2和MMP－9的表達［17］，酶譜分析表明，MMP－9在有氧條件下比缺氧條件下更能刺激明膠酶的活性，并得出HIF－1α通過MMP－9的依賴機制能促進細胞的侵襲，未來的抗腫瘤細胞藥物可直接作用于目標HIF－1α和MMP－9。另外，VEGF促使血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生MMP－9，使凝血酶原轉化為凝血酶，激活明膠酶原A降解原來的基膜，促使血管形成［10］780－786。因此HIF－1α因子在膠質瘤的增值、侵潤、轉移和復發(fā)中都有極其重要的作用，是腫瘤發(fā)生轉移、侵潤的啟動子，如果能有效的阻滯HIF－1α因子的啟動，將更加有效的控制腫瘤的侵潤乃至控制復發(fā)。

綜上所述，HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67四種因子之間相互影響、相互調(diào)控，為以后的靶向治療和臨床預后評價提供新的思路和見解，HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67四者聯(lián)合檢測可以評定腦膠質瘤的生物學行為，也可以作為評價膠質瘤復發(fā)的生物學指標。

(此文圖1－4見附頁4)

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