李東陽,王白石,崔桂花,羅 速 (.天津市泰達(dá)醫(yī)院檢驗(yàn)科,天津 00457;.天津醫(yī)科大學(xué)中新生態(tài)城醫(yī)院檢驗(yàn)科,天津 00467;.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 0;4.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 0)

乳腺癌是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤之一。隨著脂肪類食物攝入增多，女性行經(jīng)期的延長(zhǎng)，內(nèi)分泌紊亂增加等因素乳腺癌的發(fā)病率逐年升高。乳腺癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，影響因素多，病因尚不明確[1-3]。乳腺癌研究表明,雌激素受體存在使激素類信號(hào)的很多功能可以在荷爾蒙敏感的組織中發(fā)揮作用，可見雌激素受體在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵性作用[4-8]。根據(jù)乳腺癌細(xì)胞中ER-α66可分為雌激素受體陽性的激素依賴性乳腺癌和雌激素受體陰性的激素非依賴性乳腺癌[9-11]。ER-α66對(duì)人乳腺癌患者預(yù)后的判定及治療方案的設(shè)定起著至關(guān)重要的作用。

2006年美籍華人王兆一教授[12]克隆出一種ER-α66的剪接變體，命名ER-α36；發(fā)現(xiàn)證實(shí)ER-α36的功能不同與ER-α66對(duì)雌激素信號(hào)的影響[12-13]。ER-α36它主要存在于細(xì)胞膜上，并且能與雌激素和抗雌激素藥物相互作用，通過MAPK/ERK和PI3K等相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路，刺激細(xì)胞的增殖[14]。它的發(fā)現(xiàn)不難解釋抗雌激素藥物治療出現(xiàn)耐藥并且惡化的情況。本研究利用RNA干擾技術(shù)，以探討ER-α36基因與ER陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 主要材料及來源

siRNA模板序列和引物(上海生工合成)；MDA-MB-231細(xì)胞株(東北師大生命科學(xué)院研究室贈(zèng))；載體質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo、ER-α36一抗(美國(guó)王兆一教授研究室贈(zèng))；RT-PCR kit、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒、核酸內(nèi)切酶HindⅢ、核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶(均購(gòu)自大連寶生物工程公司)；lipofeetamineTM2000(Invitrogen公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、TBD血清(北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)。

1.2 RNAi質(zhì)粒的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和鑒定

1.2.1 RNAi序列的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中ER-α(NC_005100)的cDNA序列及美國(guó)王兆一教授克隆的ER-α36 cDNA的已知序列，選擇不匹配區(qū)域，按小干擾載體的設(shè)計(jì)原則，尋找符合特征的靶序列。合成針對(duì)其編碼區(qū)4560-4780堿基序列的兩條DNA寡核苷酸鏈,用Blast軟件進(jìn)行序列同源性分析,并用RNA structure 3.7軟件對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),每條模板鏈的組成包括21個(gè)特異的正義鏈和與其互補(bǔ)的21個(gè)反義鏈,正反鏈之間有10個(gè)堿基的Loop(TTGATATCCG)間隔,正義鏈之后有6個(gè)T作為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào),在模板鏈的兩端加入BamHⅠ及HindⅢ酶切位點(diǎn)。針對(duì)目的基因ER-α36的序列5′-CTGGACCAGTGCAAGATTAAA-3′設(shè)計(jì)DNA雙鏈，命名為ER-α36-siRNA；同法構(gòu)建陰性質(zhì)粒作為對(duì)照序列5′-GTACCAGCTAGACCATCAT-3′的DNA雙鏈，命名為control-siRNA。本研究構(gòu)建的ER-α36干擾序列如下，序列由上海生工合成，兩條互補(bǔ)寡核苷酸鏈退火，形成互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

ER-α36-siRNA1正義鏈:GATCCCGTTTAATCTTGCAC

TGGTCCAGTTGATATCCGCTGGACCAGTGCAAG

ATTAAATTTTTTCCAAA

ER-α36-siRNA1反義鏈:AGCTTTGGAAAAAATTTAA

TCTTGCACTGGTCCAGCGGATATCAACTCCACC

AGTGCAAGATTAAACGG

ER-α36-siRNA2正義鏈:GATCCATGATGGTCTAGCT

GGTAGGCTTCAAGAGAGCCTACCAGCTAGACCA

TCATTTTTTTA

ER-α36-siRNA2反義鏈:AGCTTAAAAAAATGATCCT

CTAGCTGGTAGGCCTCTCTTGAAGCCTACCAGC

TAGACCATCATG

1.2.2 RNAi質(zhì)粒的構(gòu)建及提取鑒定

利用分子克隆的方法先將載體質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo線性化、回收。再用T4連接酶，16 ℃水浴將目的序列與線性化載體過夜連接，構(gòu)建siRNA重組質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36-siRNA。并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞獲得重組菌。挑選陽性克隆，培養(yǎng)并制備質(zhì)粒，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切并利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將酶切鑒定正確的克隆送上海生工完成測(cè)序。成功構(gòu)建的重組菌大規(guī)模擴(kuò)增后用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA制備試劑盒按說明書步驟提取質(zhì)粒，-80 ℃保存。

1.3 RNAi重組質(zhì)粒對(duì)ER-α36基因的抑制效應(yīng)

1.3.1 MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)液(RPMI1640含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，輕吹混勻，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加足培養(yǎng)液在37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.3.2 RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞

轉(zhuǎn)染前細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化，并離心收集細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，1×105/孔接種24孔板，每孔500 μL無血清無抗生素的培養(yǎng)液。用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按說明書的比例，24孔板，細(xì)胞培養(yǎng)液500 μL，DNA 0.8 μg,LipofectamineTM2000 2.0 μL。將陰性對(duì)照質(zhì)粒和ER-α36基因重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞MDA-MB-231中，轉(zhuǎn)染6 h后，更換含有血清的全培養(yǎng)基，在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～48 h,待轉(zhuǎn)染后48 h熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

本實(shí)驗(yàn)分三組，未轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231作為空白對(duì)照組，陰性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231為陰性對(duì)照組,ER-α36基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231為hER-α36-siRNA組。每組細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配置單細(xì)胞懸液，接種到96孔板(每孔200 μL，細(xì)胞密度調(diào)至103～104/孔)，每組12個(gè)孔重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將各孔在24 h、48 h、72 h分別加入濃度為5 g/L MTT 20 μL，溫箱孵育4 h，輕輕吸去培養(yǎng)液。加入150 μL的DMSO，微振蕩器上振蕩10 min，酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定波長(zhǎng)570 nm光的吸光度(A)值。按公式抑制率%=(對(duì)照組A均值-實(shí)驗(yàn)組A均值)/對(duì)照組A均值×100%計(jì)算各組抑制率，抑制率>30%即對(duì)該藥敏感性高。

1.3.4 檢測(cè)ER-α36基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平

遵循PCR引物設(shè)計(jì)原則，根據(jù)美國(guó)王兆一教授的ER-α36基因cDNA序列，設(shè)計(jì)兩條引物，擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為909 bp，以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照,擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為661 bp。由上海生物工程公司合成。利用RT-PCR分別檢測(cè)三組基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，利用圖像分析程序，讀取圖像各條帶的灰度，從而對(duì)細(xì)胞的DNA含量進(jìn)行定量比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36 siRNA重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定

將目的片段與pRNAT-U6.1/Neo載體連接的陽性克隆測(cè)序,測(cè)得DNA序列證實(shí)含有目的片段序列(第403～423個(gè)堿基),表示質(zhì)粒構(gòu)建成功，測(cè)序見圖1。

圖 1 DNA測(cè)序圖

2.2 重組質(zhì)粒對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的影響

2.2.1 重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率

將重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑盒分別轉(zhuǎn)染在24孔板內(nèi)生長(zhǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞中，倒置熒光顯微鏡下，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，多為梭形，大小適中，核仁清晰，可見核分裂相；pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36 siRNA使MDA-MB-231細(xì)胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞皺縮，顆粒增多，細(xì)胞碎片增加。轉(zhuǎn)染48 h后通過綠色熒光蛋白(GFP)在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)70%，見圖2。

熒光顯微鏡(×100) 顯微鏡(×100)

2.2.2 重組質(zhì)粒抑制MDA-MB-231的作用

MTT法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞24-72 h生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36 siRNA重組質(zhì)粒能顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖,見圖3。

2.2.3 ER-α36在MDA-MB-231中的mRNA含量

一定循環(huán)數(shù)范圍內(nèi),擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間有良好的線性關(guān)系。我們選擇此范圍內(nèi)的28個(gè)循環(huán)為最佳擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。將構(gòu)建的pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36 siRNA表達(dá)載體及陰性對(duì)照載體轉(zhuǎn)染MB-MDA-231細(xì)胞,如圖4所示,可見載體有抑制效果。以β-actin為內(nèi)參，與未轉(zhuǎn)染的MB-MDA-231空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比抑制效率為86.3%和84.2%，P<0.01,如圖5所示。

圖 3 MTT測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖 4 MB-MDA-231細(xì)胞ER-α36mRNA表達(dá)

圖 5 轉(zhuǎn)染MB-MDA-231對(duì)ER-α36 mRNA表達(dá)影響

3 討 論

3.1 小干擾序列設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中ER-α(NC_005100)的ER基因寡核苷酸序列,及美國(guó)王兆一教授克隆的ER-α36的cDNA序列[12]，按照Qiagen公司提出的RNAi設(shè)計(jì)原則[15]：(1)在mRNA的編碼區(qū)選擇21～23nt的序列，序列中GC含量盡量接近50%，最佳GC比例在45%～55%之間。盡量不要超過60%，高于70%的話，任何序列的作用效果都要受到嚴(yán)重影響。本實(shí)驗(yàn)GC含量達(dá)到54%。(2)在同一序列中盡量避免連續(xù)3個(gè)以上的鳥嘌呤出現(xiàn)，polyG序列可以重疊形成塊狀結(jié)果，嚴(yán)重影響siRNA的作用效果。(3)優(yōu)先選擇AA起始的序列，這樣可以提高siRNA對(duì)核苷酸酶的抵抗性。(4)通過BLAST軟件確保所選片段與任何已知基因無同源性?；谏鲜鲈瓌t本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)出沉默ER-α36基因表達(dá)的RNAi序列。交由上海生工合成上、下游引物。通過引物的退火條件成功合成帶有粘性末端的小干擾DNA序列。

3.2 siRNA載體構(gòu)建

雙酶切、PCR及測(cè)序結(jié)果均證實(shí)重組質(zhì)粒即為克隆含目的序列的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36-siRNA的構(gòu)建成功為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用pRNAT-U6.1/Neo作為載體構(gòu)建小干擾重組質(zhì)粒，在真核細(xì)胞中表達(dá),其U6啟動(dòng)子位于編碼序列的上游,能夠啟動(dòng)多克隆位點(diǎn)上的目的shRNA轉(zhuǎn)錄,最大的優(yōu)點(diǎn)是可以精確地起始和終止RNA轉(zhuǎn)錄,且表達(dá)量豐富[16]。其CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)GFP(綠色熒光蛋白)轉(zhuǎn)錄,便于觀察載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率,優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。含有新霉素抗性基因(Neo),可以由G-418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞;含有可以進(jìn)行長(zhǎng)期基因沉默的氨芐抗性基因(Amp),能在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中大量擴(kuò)增。應(yīng)用該質(zhì)粒能夠有效、持久地產(chǎn)生針對(duì)靶基因的shRNA，并且便于檢測(cè)。從而有助于更精確評(píng)價(jià)抑制靶基因的效果。

3.3 重組質(zhì)粒干擾沉默ER-α36對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的影響

3.3.1 小干擾重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞中可以觀察到一定量綠色熒光蛋白。因此可以認(rèn)為轉(zhuǎn)染的重組質(zhì)粒在細(xì)胞中有較高的表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑為脂質(zhì)體LipofectamineTM2000。該轉(zhuǎn)染試劑是最新一代的轉(zhuǎn)染試劑代表，具有高轉(zhuǎn)染率、高檢出率、低細(xì)胞毒性等特點(diǎn)。通過熒光顯微鏡對(duì)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行觀察，與未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照。由于GFP基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(非分泌蛋白)，在紫外光激發(fā)下發(fā)綠色熒光，便于觀察轉(zhuǎn)染效率、操作簡(jiǎn)捷、快速，為下一步實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

3.3.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況

細(xì)胞水平上，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法，檢測(cè)出pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36-siRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞MDA-MB-231，分別檢測(cè)到24 h、48 h及72 h細(xì)胞增殖情況，隨時(shí)間增加，抑制效率逐步增強(qiáng)(時(shí)間觀察點(diǎn)72 h抑制強(qiáng)度達(dá)到最大74.4%)，表明ER-α36基因沉默對(duì)細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，提示ER-α36通過MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與雌激素受體陰性乳腺癌的細(xì)胞增殖，在雌激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。其作用機(jī)制和相關(guān)因子還需進(jìn)一步研究。

3.3.3 ER-α36在細(xì)胞中mRNA含量的檢測(cè)

轉(zhuǎn)錄水平上，本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR法設(shè)計(jì)ER-α36的特異引物，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，結(jié)果顯示ER-α36-siRNA組表達(dá)明顯下降。說明該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可有效抑制雌激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞中ER-α36基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)從轉(zhuǎn)錄水平小干擾有效抑制了ER-α36的表達(dá)，為雌激素受體陰性乳腺癌的治療提供了新的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)將ER-α36作為“靶”,RNAi技術(shù)作為“箭”，首次應(yīng)用小干擾技術(shù)在雌激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中對(duì)ER-α36進(jìn)行了研究。初步探討了ER-α36基因在雌激素受體陰性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制,及ER-α36的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(MPAK/EAK)[17]與雌激素受體陰性乳腺癌的相關(guān)性問題。ER-α36作為雌激素受體調(diào)控的重要組成部分之一，和其他雌激素受體相比，與雌激素受體陰性乳腺癌的關(guān)系更為密切。ER-α36可能成為雌激素受體陰性乳腺癌基因治療的新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙士偉,劉 欣,鄭桂麗,等.乳腺癌Her-2基因擴(kuò)增及其蛋白表達(dá)與ER、PR的關(guān)系及臨床意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013，21(5)：1038-1040.

[2] 王深明，林 穎.關(guān)注乳腺癌早期診斷和治療的進(jìn)展[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011,28(5):647-649.

[3] 赫 萌,李 芳.ERR促進(jìn)乳腺癌發(fā)生的作用機(jī)制[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2013,25(6):733-735.

[4] Sharma M.Apoptosis-antagonizing transcription factor (AATF) gene silencing:role in induction of apoptosis and down-regulation of estrogen receptor in breast cancer cells[J].Biotechnol Lett,2013，35(10):1561-1570.

[5] 譚小寧,周 知,謝小雷,等.雌激素受體信號(hào)通路在乳腺癌發(fā)生和治療中的作用[J].生命科學(xué)，2011,23(10)：969-974.

[6] 姜雨飛，王世鄂.雌激素受體ERα與PI3K/Akt細(xì)胞信號(hào)通路[J].解剖學(xué)研究，2012,34(2):142-145.

[7] 宿恒川,孫?？?PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及mTOR抑制劑在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的研究進(jìn)展[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，32(5)：674-678.

[8] 郭少峰，王小明，趙金華，等.雌激素受體和孕激素受體表達(dá)與乳腺癌臨床病理相關(guān)性分析[J].華西醫(yī)學(xué)，2014，29(1)：47-50.

[9] Zhang Lin，Yang Nuo,Mohamed Hadley A,et al.Vector-based RNAi,a novel tool for isoform-specific knock-down of VEGF and anti-angiogenesis gene therapy of cancer[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,303(4):1169-1178.

[10] Denli A M,Hannon G J.RNAi:an ever-growing puzzle[J].Trends Biochem Sci，2003,28(4):196-201.

[11] Fire A,Xu Siqun,Montgomery M K,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，2004,391(6669):806-811.

[12] Wang Zhaoyi,Zhang Xintian,Shen Peng,et al.A variant of estrogen receptor-alpha,hER-alpha36:transduction of estrogen-and antiestrogen-dependent membrane-initiated mitogenic signaling[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103:9063-9068.

[13] 劉旺根.雌激素受體-α 36過表達(dá)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7生物學(xué)行為的影響[D].鄭州:鄭州大學(xué),2012.

[14] Chaudhri R A,Schwartz N,Elbaradie K，et al.Role of ERα36 in membrane-associated signaling by estrogen[J].Steroids，2013，81C:74-80.

[15] Elbashir S M，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells [J].Nature,2001,411(6836):494-498.

[16] Dykxhoorn D M,Novina C D,Sharp P A.Killing the messenger:short RNAs that silence gene expression[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2003，4(6):457-467.

[17] Lee L M,Cao Jiang,Deng Hao,et al.ER-alpha36,a novel variant of ER-alpha,is expressed in ER-positive and -negative human breast carcinomas[J].Anticancer Res，2008，28(1B):479-483.