宮 丹，鐘 越，曹紅梅，韓麗琴，王長(zhǎng)文，趙文秀* (.解放軍第醫(yī)院血液腫瘤科,吉林 吉林 30；.吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 303)

表阿霉素(Epirubicin，EPI)和阿霉素(Adriamy cin,ADR)是多種腫瘤的一線化療藥物，主要用于白血病、淋巴瘤、乳腺癌和肝癌等腫瘤的治療。EPI和ADR均具有劑量依賴的心臟毒性，減少其用量可減少其心臟毒副性[1]。鎢磷酸鹽(K6[P2W18O62]·14H2O)為課題組合成的抗腫瘤多酸，對(duì)卵巢癌、乳腺癌和白血病等腫瘤具有抑制作用[2]。本研究采用鎢磷酸鹽與EPI聯(lián)合處理白雪病細(xì)胞K562，分析鎢磷酸鹽對(duì)細(xì)胞內(nèi)化EPI，以及抗腫瘤效應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

白血病細(xì)胞K562凍存液氮中。鎢磷酸鹽(K6[P2W18O62]·14H2O)由本課題組合成和晶體結(jié)構(gòu)表征，純度為93.7%。表阿霉素注射液為無(wú)錫輝瑞制藥有限公司產(chǎn)品?；钚匝跆结橂p氯熒光黃乙酸乙酯(Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)和WST-1購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理

復(fù)蘇K562細(xì)胞,用在含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液、37 ℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)。每周傳代3次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。調(diào)細(xì)胞密度為4×104/mL,按每孔100 μL接種96孔培養(yǎng)板；用培養(yǎng)液稀釋鎢磷酸鹽(K6[P2W18O62]·14H2O)和表阿霉素，并加入各孔；在不同濃度鎢磷酸鹽(0和12.5 μmol/L)和表阿霉素(0、2.5、5和100 μmol/L)處理細(xì)胞72 h后，WST-1還原法檢測(cè)細(xì)胞增殖。調(diào)細(xì)胞密度為4×104/mL,按每瓶10 mL接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，不同濃度鎢磷酸鹽(0、25、50和100 μmol/L)和表阿霉素(0、2.5、5和10 μmol/L)處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧、細(xì)胞內(nèi)表阿霉素相對(duì)含量和細(xì)胞凋亡。

1.3 細(xì)胞增殖分析

參照文獻(xiàn)方法，檢測(cè)細(xì)胞增殖：取96孔板，按每孔10 μL加入WST-1溶液，37 ℃孵育2 h后，酶標(biāo)分析儀檢測(cè)450 nm吸光度值并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(inhibition rate,IR)[3]。

1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)

收集細(xì)胞后用PBS調(diào)至密度為2×106/mL的細(xì)胞懸液，取500 μL細(xì)胞懸液，加入DCFH-DA儲(chǔ)存液，至其終濃度為5 μmol/L，混勻后在37 ℃避光反應(yīng)30 min，PBS洗2次后用流式細(xì)胞儀分析。

1.5 表阿霉素相對(duì)含量分析

參照文獻(xiàn)，本研究利用ADR發(fā)射的紅色熒光，分析細(xì)胞ADR的相對(duì)含量[4]。

2 結(jié) 果

2.1 鎢磷酸鹽和表阿霉素對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響

不同濃度鎢磷酸鹽和表阿霉素處理72 h，對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制率見表1。12.5 μmol/L的鎢磷酸鹽單獨(dú)作用對(duì)K562細(xì)胞僅有較弱的抑制作用，但與表阿霉素聯(lián)合作用，可顯著提高抗腫瘤效應(yīng)。參照文獻(xiàn)，采用金正均法計(jì)算鎢磷酸鹽與表阿霉素的聯(lián)合指數(shù)[4]。12.5 μmol/L鎢磷酸鹽與2.5、5和10 μmol/L表阿霉素的聯(lián)合指數(shù)分別為1.62、1.29和1.02，計(jì)算結(jié)果表明鎢磷酸鹽與2.5和5 μmol/L的EPI具有聯(lián)合作用，而與10 μmol/L表阿霉素具有加合作用。

2.2 鎢磷酸鹽促進(jìn)K562細(xì)胞內(nèi)化表阿霉素

阿霉素和表阿霉素發(fā)射紅色光，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光，參照文獻(xiàn)方法用F2通道的平均熒光強(qiáng)度值代表細(xì)胞內(nèi)表阿霉素的相對(duì)含量。結(jié)果表明，12.5 μmol/L的鎢磷酸鹽可促進(jìn)阿霉素進(jìn)入K562細(xì)胞內(nèi)(表2)。

表 1 鎢磷酸鹽和表阿霉素對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響

表 2 鎢磷酸鹽和表阿霉素對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)化阿霉素的影響

2.3 鎢磷酸鹽和表阿霉素對(duì)K562細(xì)胞活性氧影響

DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解為DCFH，該物質(zhì)被氧化后生成DCF，而DCF發(fā)射的熒光可采用流式細(xì)胞儀525 nm通道(FL1)來檢測(cè),其熒光強(qiáng)度值代表細(xì)胞內(nèi)ROS水平。分析表明，鎢磷酸鹽和表阿霉素聯(lián)合處理組細(xì)胞ROS含量低于表阿霉素單獨(dú)作用組(表3)。

表 3 鎢磷酸鹽和表阿霉素對(duì)K562細(xì)胞ROS含量的影響

3 討 論

EPI是臨床常用的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物(anthracy cline,ATC),但該藥有劑量累積心臟毒性。體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)高濃度的EPI對(duì)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞有損傷作用，而降低EPI濃度，則損傷作用減輕。近年來,國(guó)內(nèi)外在EPI心臟毒性方面進(jìn)行了一定的探索,發(fā)現(xiàn)還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)等氧自由基清除劑對(duì)其引起的心臟毒性有保護(hù)作用[2]。多酸化合物又稱多金屬氧酸鹽(Polyoxometalates),是一類金屬-氧簇合物。1971年,Raynaud等首次報(bào)道鎢硅雜多酸鹽具有抑制小鼠白血病肉瘤病毒的作用。此后,多酸化合物除傳統(tǒng)地被用作化學(xué)合成的催化劑外,部分多酸化合物因具有抗腫瘤和抗病毒作用,引起醫(yī)藥領(lǐng)域的重視[5]。本課題組參照文獻(xiàn)合成Dawson結(jié)構(gòu)鎢磷酸鉀鹽化合物[7],其結(jié)構(gòu)式為K6[P2W18O62]·14H2O,采用腫瘤細(xì)胞系體外培養(yǎng)模型,發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種抗腫瘤具有抑制作用，并可促表阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在此基礎(chǔ)上，本研究探討低濃度的K6[P2W18O62]·14H2O與EPI聯(lián)合抗腫瘤的效應(yīng)和機(jī)制。

通過研究發(fā)現(xiàn)，鎢磷酸鹽(15 μmol/L)與阿霉素(2.5、5和10μ mol/L)的聯(lián)合指數(shù)分別為1.62和1.29，即兩者具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)；鎢磷酸鹽可促進(jìn)阿霉素內(nèi)化入細(xì)胞并降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。因此，鎢磷酸鹽可能通過促進(jìn)表阿霉素內(nèi)化入細(xì)胞而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤的作用。值得注意的是，在獲得相同抗腫瘤效應(yīng)下，鎢磷酸鹽可降低EPI的用量，并降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量。蒽環(huán)類抗腫瘤藥物類抗癌藥物的心臟毒性為劑量依賴、機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)活性氧量過高導(dǎo)致的線粒體功能下降有關(guān)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)鎢磷酸鹽與阿霉素協(xié)同效應(yīng)，并初步研究了其兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧的降低效應(yīng)，值得進(jìn)一步補(bǔ)充體內(nèi)外研究，深入探討其作用機(jī)理和應(yīng)用價(jià)值。

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