牛衛(wèi)東　戴蕾　史軍

【摘要】 目的：對(duì)鄭州市首例人感染H7N9禽流感病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷和分析，以提高實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測(cè)能力。方法：采集鄭州市管城區(qū)1例疑似病例的鼻、咽拭子樣本，提取病毒RNA，采用甲、乙型流感通用引物和探針、季節(jié)性流感（包括H1N1、H3N2）特異性引物和探針、甲型H1N1流感特異性引物和探針以及H5N1和H7N9特異性引物和探針，以Real-time RT-PCR方法檢測(cè)流感病毒核酸。結(jié)果：乙型流感、季節(jié)性流感（包括H1N1、H3N2）、甲型H1N1流感和H5N1高致病性禽流感擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；甲型流感通用引物和H7N9亞型流感病毒擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性。結(jié)論：樣本經(jīng)河南省疾控中心與國(guó)家疾控中心復(fù)核檢測(cè)，證實(shí)該患者為鄭州市首例人感染H7N9禽流感病例。

【關(guān)鍵詞】 禽流感； H7N9； Real-time RT-PCR

自2013年2月起，我國(guó)上海和安徽等地先后出現(xiàn)不明原因重癥肺炎病例，之后被確診為人感染H7N9禽流感。此前報(bào)道的可感染人的禽流感病毒亞型為H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3[1-3]。H7N9亞型主要在野生鳥(niǎo)類中間傳播，在此之前無(wú)人感染病例。甲型流感病毒可以通過(guò)基因重組而改變其抗原性，人類歷史上幾次流感大流行的病毒株都是通過(guò)人類季節(jié)性流感病毒和動(dòng)物流感病毒的基因重組而來(lái)[4-5]。人感染H7N9禽流感病毒為新型重配病毒，其內(nèi)部基因來(lái)自于H9N2禽流感病毒[2]。人感染H7N9禽流感是由H7N9亞型禽流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，是一種新型呼吸道傳染病。本文對(duì)鄭州市首例人感染H7N9禽流感病例的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法和過(guò)程進(jìn)行了總結(jié)和分析，旨在進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室對(duì)該類病例的應(yīng)急檢測(cè)能力，這對(duì)相關(guān)病例的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早隔離、早治療，防止疫情擴(kuò)散，降低病死率具有十分重要意義。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 患者王某，男，38歲，漢族，農(nóng)民，從事活禽宰殺銷售工作。患者自述4月8日出現(xiàn)畏寒、咽痛，自行服藥治療，病情未見(jiàn)好轉(zhuǎn)，于4月11日上午前往鄉(xiāng)衛(wèi)生院就診，初步診斷為“左下葉肺炎”。下午患者自行到鄭州市某市級(jí)醫(yī)院急診科就診，CT診斷報(bào)告為：左肺下葉炎癥?；颊咭浴胺窝住鞭D(zhuǎn)至省傳染病醫(yī)院隔離排查。當(dāng)晚，鄭州市疾控中心實(shí)驗(yàn)室采集患者的鼻咽拭子樣本進(jìn)行Real-time RT-PCR檢測(cè)，檢驗(yàn)結(jié)果顯示患者H7N9禽流感病毒核酸陰性，鑒于患者為禽類接觸的高危人群，疾控機(jī)構(gòu)持續(xù)關(guān)注患者病情變化。4月16日，省傳染病醫(yī)院報(bào)告該患者病情出現(xiàn)進(jìn)行性加重，故市疾控中心再次采集患者鼻咽拭子和下呼吸道分泌物標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，4月17日初步檢測(cè)結(jié)果為H7N9禽流感病毒核酸陽(yáng)性。4月18日，省疾控中心復(fù)核檢測(cè)陽(yáng)性。經(jīng)省級(jí)專家組會(huì)診，判定為人感染H7N9禽流感病例。

1.2 檢測(cè)試劑與儀器 病毒核酸提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；甲乙型流感、季節(jié)性流感（包括H1N1、H3N2）、甲型H1N1流感和H5N1高致病性禽流感病毒RNA檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）均購(gòu)自北京金豪制藥股份有限公司；人感染H7N9禽流感病毒RNA檢測(cè)使用的AM1005試劑盒（熒光PCR法）購(gòu)自ABI公司；人感染H7N9禽流感特異性引物和探針由國(guó)家疾控中心下發(fā)；采用Real-time RT-PCR方法，運(yùn)用Bio-Rad CFX96和Bio-Rad IQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行流感病毒核酸檢測(cè)[6]。

1.3 引物和探針 由國(guó)家疾控中心下發(fā)的人感染H7N9禽流感特異性引物和探針序列見(jiàn)表1。

表1 人感染H7N9禽流感特異性引物和探針序列

引物和探針名稱 序列（5-3）

CNIC-H7F AGAAATGAAATGGCTCCTGTCAA

CNIC-H7R GGTTTTTTCTTGTATTTTTATATGACTTAG

CNIC-H7Probe1 FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1

CNIC-N9F TGGCAATGACACACACTAGTCAGT

CNIC-N9R ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT

CNIC-N9Probe1 FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1

1.4 檢驗(yàn)方法與步驟

1.4.1 核酸提取 吸取5.6 ?L Carrier RNA至含560 ?L AVL的Eppendorf離心管中，吹打混勻。加200 ?L標(biāo)本到上述離心管中，吹打混勻，安全柜內(nèi)孵育10 min。加560 ?L無(wú)水乙醇（96%～100%）到離心管中，吹打混勻。吸取660 ?L溶液至Rnase-free吸附柱CR2中，蓋上離心管帽，7000 rpm離心1 min棄掉套管。重復(fù)一次。加500 ?L緩沖液GD，蓋上離心管帽，7000 rpm離心1 min，棄掉套管。加500 ?L漂洗液RW，蓋上離心管帽，11 000 rpm離心3 min，棄掉套管。將吸附柱放入一個(gè)新的1.5 mL無(wú)RNA酶離心管中，打開(kāi)吸附柱蓋子，放置3 min，使吸附膜完全變干，加入70 ?L Rnase-free ddH2O，蓋上蓋子，孵育5 min，7000 rpm離心1 min，收集病毒RNA模板。

1.4.2 Real-time RT-PCR 人感染H7N9禽流感檢測(cè)使用ABI公司的AM1005試劑盒進(jìn)行體系配制，反應(yīng)總體積為25 μL，組分構(gòu)成見(jiàn)表2。

表2 人感染H7N9禽流感擴(kuò)增體系組分構(gòu)成

組分 體積（μL）

2×RT-PCR Buffer 12.5

25×RT-PCR Enzyme Mix 1.0

H7上游引物 0.5

H7下游引物 0.5

H7探針 0.5

N9上游引物 0.5

N9下游引物 0.5

N9探針 0.5

RNase Free Water 3.5

將上述反應(yīng)液混勻，分裝每管20 μL，將5 μL模板加入分裝好的PCR小管，分別做好標(biāo)記。同時(shí)分別以DEPCH2O和RNA陽(yáng)性模板作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。使用Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。

甲乙型流感、季節(jié)性流感（包括H1N1、H3N2）、甲型H1N1流感和H5N1高致病性禽流感檢測(cè)分別使用北京金豪公司的系列試劑盒進(jìn)行體系配制，反應(yīng)總體積均為25 μL，組分構(gòu)成見(jiàn)表3。

表3 甲乙型流感、季節(jié)性流感（包括H1N1、H3N2）、甲型H1N1流感和H5N1高致病性禽流感擴(kuò)增體系組分構(gòu)成

組分 體積（μL）

Mix 20

Tag聚合酶 1

逆轉(zhuǎn)錄酶 0.35

將上述反應(yīng)液混勻，分裝每管20 μL，加入5 μL模板，分別做好標(biāo)記。同時(shí)分別以DEPCH2O和RNA陽(yáng)性模板作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。使用Bio-Rad IQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 30 min，95 ℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 本疾控中心檢測(cè)結(jié)果 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，甲型流感通用引物、H7和N9特異性引物的擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性，其中H7和N9特異性引物的擴(kuò)增結(jié)果結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 省疾控中心和國(guó)家疾控中心復(fù)核檢測(cè)結(jié)果 按照《人感染H7N9禽流感疫情防控方案》要求，鄭州市疾控中心將初步檢測(cè)呈陽(yáng)性的樣本送至河南省疾控中心和國(guó)家疾控中心進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)，結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果一致，證實(shí)該病例樣本人感染H7N9禽流感病毒核酸陽(yáng)性。

3 討論

自2013年2月份以來(lái)，人感染H7N9禽流感疫情已波及我國(guó)多個(gè)省份，病例數(shù)持續(xù)增加，但截至目前病例分布仍呈現(xiàn)高度散發(fā)的特點(diǎn)，尚無(wú)人傳人的確切證據(jù)[7-9]。傳染源目前尚不明確，推測(cè)可能為攜帶H7N9禽流感病毒的禽類及其分泌物或排泄物。根據(jù)現(xiàn)已掌握的流行病學(xué)資料，患者多為從事禽類養(yǎng)殖、銷售、宰殺、加工業(yè)者，以及在發(fā)病前1周內(nèi)接觸過(guò)禽類者[10-11]。鄭州市首例人感染H7N9禽流感患者王某正是從事活禽宰殺銷售工作的，發(fā)病前與禽類有明確的接觸史。

甲型流感病毒血清型較多，發(fā)病初期的臨床癥狀又較為相似，這為病例的臨床鑒別診斷帶來(lái)了較高的難度。人感染H7N9禽流感重癥患者預(yù)后差。重癥患者病情發(fā)展一般十分迅速，表現(xiàn)為重癥肺炎，體溫39 ℃以上，常發(fā)生呼吸困難；病情進(jìn)一步惡化出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征、休克及急性腎損傷等，病死率較高[2-3]。因此，實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確、高效的診斷技術(shù)，對(duì)于疑似病例的早診斷、早治療，減輕患者的病痛，挽救患者的生命具有重要意義。目前最準(zhǔn)確的診斷方法就是從患者呼吸道分泌物標(biāo)本中分離出H7N9禽流感病毒或H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性[12-14]。Real-time RT-PCR檢測(cè)流感病毒核酸，方法成熟、敏感度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，是目前實(shí)驗(yàn)室首選的快速檢測(cè)方法[15]。

流感樣病例標(biāo)本采集質(zhì)量的好壞是實(shí)驗(yàn)室能否得到客觀、準(zhǔn)確診斷結(jié)論的前提和基礎(chǔ)，臨床上對(duì)此應(yīng)該給予高度重視。在本次人感染H7N9禽流感病例的首次實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本采集和檢驗(yàn)中，檢測(cè)結(jié)果為陰性。在幾天之后的二次標(biāo)本采集和檢驗(yàn)中，檢測(cè)結(jié)果又為陽(yáng)性。在兩次病例標(biāo)本的采集和檢驗(yàn)過(guò)程中，相同點(diǎn)是均是使用同批次的病毒采樣管和檢驗(yàn)試劑、同樣的儀器設(shè)備和檢驗(yàn)方法；不同點(diǎn)是兩次標(biāo)本采集的采樣人員不同，所采集標(biāo)本的種類亦不相同，同時(shí)患者的病情也在不斷地發(fā)展變化過(guò)程之中。筆者分析造成兩次實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果不一致的原因大概有兩種可能：一是第一次檢測(cè)的標(biāo)本采集質(zhì)量不過(guò)關(guān)。流感樣病例標(biāo)本的采集首先應(yīng)選用合格的病毒采樣管和聚丙烯纖維頭拭子進(jìn)行采樣。其次，采樣部位要準(zhǔn)確。咽拭子應(yīng)采集患者的懸雍垂后咽后壁及雙側(cè)扁桃體，應(yīng)盡量避免接觸舌頭、口腔內(nèi)壁等含菌較高的部位。鼻拭子應(yīng)深入鼻鄂部采集。最后應(yīng)注意的是，采樣要有一定的力度，盡可能的多采集一些標(biāo)本。在第一次標(biāo)本采集過(guò)程中，有可能是在采樣部位上掌握的不夠準(zhǔn)確，或是采樣力度不夠造成了標(biāo)本采集質(zhì)量不過(guò)關(guān)。二是第二次檢測(cè)的標(biāo)本更具有典型性。第二次標(biāo)本采集除了采集了患者的鼻、咽拭子外，醫(yī)院方面還使用專用設(shè)備采集了患者的下呼吸道分泌物，這更加符合人感染H7N9禽流感病例標(biāo)本的要求，提高了病毒檢測(cè)的陽(yáng)性率。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)做好相關(guān)檢驗(yàn)技術(shù)和物資的貯備，建立健全應(yīng)急檢驗(yàn)工作預(yù)案，做到有條不紊地應(yīng)對(duì)流感疫情等突發(fā)公共衛(wèi)生事件。本文詳細(xì)介紹了鄭州市首例人感染H7N9禽流感病例的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法和過(guò)程，旨在進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測(cè)能力，為流感疫情的防控提供及時(shí)可靠的診斷依據(jù)。

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（收稿日期：2014-04-16） （本文編輯：蔡元元）

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（收稿日期：2014-04-16） （本文編輯：蔡元元）