韓 韻，魏國芬，張 霞，連盼盼，王金麗，呂鑒泉

(湖北師范學(xué)院 污染物分析與資源化技術(shù)湖北省重點(diǎn)實驗室， 湖北 黃石 435002)

毛細(xì)管電泳-光纖光譜聯(lián)用技術(shù)檢測結(jié)晶紫

韓 韻，魏國芬，張 霞，連盼盼，王金麗，呂鑒泉

(湖北師范學(xué)院 污染物分析與資源化技術(shù)湖北省重點(diǎn)實驗室， 湖北 黃石 435002)

開發(fā)新型毛細(xì)管電泳-光纖光譜聯(lián)用技術(shù)并應(yīng)用于結(jié)晶紫的快速檢測。以結(jié)晶紫為對象，考察了電泳和溶液條件對結(jié)晶紫的分離分析信號的影響。結(jié)果表明，檢測結(jié)晶紫的最佳條件為：流動相是0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 4.0)，檢測波長590 nm，分離電壓3 kV，進(jìn)樣時間60 s.在最佳條件下，吸光度與0.8～10 μg/mL結(jié)晶紫呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9954，檢出限為0.8 μg/mL.方法成功地應(yīng)用于水體中結(jié)晶紫的快速檢測。

檢測;結(jié)晶紫;毛細(xì)管電泳;光纖光譜

毛細(xì)管電泳(CE)是一種新型高效分離技術(shù)，以其柱效高、分析速度快、選擇性高、試樣消耗少等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛用于醫(yī)藥衛(wèi)生、生化、環(huán)境等領(lǐng)域[1]。近年來，毛細(xì)管電泳與多種檢測器聯(lián)用使得其應(yīng)用范圍更加寬廣。Smith等將CE與改進(jìn)電噴霧口連接，實現(xiàn)了CE-MS聯(lián)用[2～5]，Cheng等將激光熒光檢測器與CE聯(lián)用[6]，電化學(xué)檢測器的聯(lián)用使得單個神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)液樣品分析成為可能[7]。Morris發(fā)展了激光拉曼光譜檢測法[8]，Huang等將電導(dǎo)檢測器與CE聯(lián)用，用于堿金屬離子等樣品的檢測[9]。Kuhr等利用間接熒光法與CE聯(lián)用，用于多種天然氨基酸的分離檢測[10]。

光纖光譜儀是近年發(fā)展起來的一種新型光譜儀，其光譜響應(yīng)范圍寬，響應(yīng)時間短，信噪比高，具有優(yōu)秀的光學(xué)分辨率，高度集成化、模塊化可自由搭配，實現(xiàn)了一機(jī)多模檢測[11]，具有廣闊的應(yīng)用前景。加州大學(xué)伯克利分校Benhabib課題組利用多通道毛細(xì)管電泳為分離設(shè)備與光纖光譜儀的熒光檢測模式聯(lián)用證實了火星中有機(jī)物大分子和生物標(biāo)記物的存在[12]。亞利桑那大學(xué)Hayes等在聯(lián)用基礎(chǔ)上利用紫外檢測器開發(fā)出電泳排阻法，成功用于部分堿性染料的分離富集，隨后將其應(yīng)用于帶異種電荷蛋白質(zhì)的同時分離富集[13～15]。該方法主要建立在物理學(xué)角度，重現(xiàn)性差，分離能力有限，并不具有廣泛的應(yīng)用前景。

結(jié)晶紫或稱龍膽紫，屬堿性三苯甲烷類染料，具有高效的抗菌性，曾被廣泛應(yīng)用于魚類疾病的抗菌藥。然而近年來，國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)結(jié)晶紫通過生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化富集，具有“三致”效應(yīng)，被列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物行列[16，17]。本文將毛細(xì)管電泳與光纖光譜儀器連接起來，構(gòu)建一種新的聯(lián)用技術(shù)，采用紫外可見檢測構(gòu)建毛細(xì)管電泳-光纖光譜儀聯(lián)用系統(tǒng)，并以結(jié)晶紫為模型化合物考察了聯(lián)用系統(tǒng)的條件。

1 實驗部分

1.1試劑

乙腈(色譜純)，結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸、磷酸二氫鈉、乙酸、乙酸銨等分析純試劑均產(chǎn)于天津科密歐公司，用水均為雙重蒸餾水。結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)儲備液(0.1 mg/mL)：準(zhǔn)確稱取0.0100 g結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定溶至100mL.

1.2儀器與實驗條件

HR4000光纖光譜儀、DH2000 UV-VIS-NIR光源、CUV-CCE毛細(xì)管電泳通道均由美國Ocean Optic公司產(chǎn)，GY-6型高壓電源(東北大學(xué)分析科學(xué)研究中心)，石英毛細(xì)管柱19 cm×75 μm(河北永年光導(dǎo)纖維廠)。

1.3實驗方法

所有溶液使用前均用0.45 μm濾膜過濾，每次實驗前分別用0.1 mol/L NaOH，0.1 mol/L HCl，二次水，緩沖溶液沖洗毛細(xì)管各5 min，以0.1 mol/L，pH 4.0的磷酸緩沖溶液為緩沖介質(zhì)，采用高度差進(jìn)樣，進(jìn)樣高度15 cm，進(jìn)樣時間60 s，分離電壓3 kV，檢測波長590 nm，實驗溫度為室溫。

2 結(jié)果與討論

2.1儀器構(gòu)造

自組裝毛細(xì)管電泳-光纖光譜聯(lián)用裝置如圖1所示。CUV-CCE接口固定于水平可移動板上，與Foret等人研制出的接口[18]相比，配套光纖通過特有的套管可保證光路準(zhǔn)確通過毛細(xì)管光窗，消除電泳系統(tǒng)中的壓力限制，輕巧的設(shè)計方便拆卸和攜帶，具有更強(qiáng)的便攜性和儀器穩(wěn)定性。

2.2緩沖溶液pH的優(yōu)化

選用常見的毛細(xì)管區(qū)帶電泳緩沖溶液磷酸-磷酸二氫鈉做為緩沖介質(zhì)，分別考察不同pH下樣品分離情況，分離電壓3 kV，進(jìn)樣高度15 cm，進(jìn)樣時間60 s，樣品濃度0.1 mg/mL，檢測波長590 nm.不同pH下電泳譜圖如圖2所示。

圖1 毛細(xì)管電泳-光纖光譜聯(lián)用裝置示意圖

圖2 pH優(yōu)化電泳譜圖

結(jié)果表明，pH小于4.0時，柱效較差，而pH為4.5時，電流噪聲較大，信噪比較小，故選擇pH 4.0為最優(yōu)緩沖pH.

2.3分離電壓的優(yōu)化

考察了不同分離電壓時對分離效率的影響，樣品在pH為4.0的緩沖介質(zhì)中，檢測波長為590 nm不同分離電壓的電泳譜圖如圖3所示。

由圖可知，當(dāng)分離電壓為3 kV時，柱效高，出峰時間短，故選擇3 kV為最優(yōu)分離電壓。

2.4緩沖介質(zhì)的優(yōu)化

考慮毛細(xì)管區(qū)帶電泳中常用緩沖試劑：磷酸鹽、硼酸或硼砂、醋酸鹽，由于硼酸鹽緩沖溶液pH范圍為堿性，不符合結(jié)晶紫分離需求。本實驗只對磷酸體系和醋酸體系進(jìn)行考察。分別配制pH 4.0，1 mmol/L磷酸-磷酸二氫鈉和醋酸-醋酸銨為緩沖介質(zhì)，對同一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行電泳分離，分離電壓3 kV，檢測波長為590 nm，電泳譜圖如圖4所示。

圖3 電壓優(yōu)化電泳譜圖

圖4 緩沖介質(zhì)優(yōu)化電泳譜圖

從圖中可以看出，當(dāng)緩沖體系為醋酸-醋酸銨時，半峰寬較大，信噪比較小，故選擇磷酸-磷酸二氫鈉為緩沖體系。

2.5緩沖溶液濃度優(yōu)化

考察了不同濃度的磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液對分離效率的影響，選擇濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mol/L，pH為4.0的磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液進(jìn)行實驗，分離電壓3 kV，檢測波長590 nm。電泳譜圖如圖5所示。

圖中可見，當(dāng)濃度為0.1 mol/L時，分離效率最高，濃度大于0.1 mol/L時，電流焦耳熱較大，管內(nèi)易產(chǎn)生空泡，故選擇0.1 mol/L的磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液為最佳濃度。

2.6進(jìn)樣時間優(yōu)化

由于自組裝毛細(xì)管電泳系統(tǒng)手動進(jìn)樣誤差較大，選擇相對低的進(jìn)樣高度和相對長的進(jìn)樣時間可以減小系統(tǒng)誤差，考察了40、50、60、70、80 s五個不同進(jìn)樣時間對分離效率的影響。所用緩沖體系pH=4.0，濃度為0.1 mol/L磷酸-磷酸二氫鈉緩沖，分離電壓3 kV，檢測波長為590 nm.電泳譜圖如圖6所示。

圖5 緩沖溶液濃度優(yōu)化電泳譜圖

圖6 進(jìn)樣時間優(yōu)化電泳譜圖

圖7為不同進(jìn)樣時間的峰高變化。由圖中可見，進(jìn)樣時間為60 s時，峰高峰型均為最優(yōu)，故選擇60 s為最佳進(jìn)樣時間。

2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取結(jié)晶紫母液分別稀釋至0.8、3、5、8、10 μg/mL，按照上述最優(yōu)條件進(jìn)行實驗，繪制出峰高Abs

與濃度c標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系如圖9所示。計算得回歸方程為y=5.47X+0.0097，相關(guān)系數(shù)R2=

0.9954檢出限(S/N=3)為0.8 μg/mL，對5 μg/mL結(jié)晶紫平行測定5次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%.

2.8樣品分析

本實驗條件下，未知水樣經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，未檢測出結(jié)晶紫。在水樣中加入標(biāo)準(zhǔn)結(jié)晶紫溶液，回收率為95.23%～103.15%.實驗結(jié)果表明，該聯(lián)用體系穩(wěn)定性良好，可用于實際樣品分析。

圖7 進(jìn)樣時間對峰高的影響

圖8 濃度c與峰高Abs關(guān)系

3 結(jié)論

本文首次成功構(gòu)建了毛細(xì)管區(qū)帶電泳-光纖光譜聯(lián)用快速檢測新方法，并以結(jié)晶紫為模型化合物對該方法進(jìn)行考察，與文獻(xiàn)比照實驗檢出限相近(見表1)，該方法可對待測物進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析檢測。

表1 不同方法線性范圍和檢出限比較

[1]肖虎勇.毛細(xì)管電泳聯(lián)用技術(shù)在食用油分析中的應(yīng)用[D]．湖北師范學(xué)院，2013.

[2]Olivares J A, Nguyen N T, Yonker C R, et al.On-line mass spectrometric detection for capillary zone electrophoresis [J]. Anal Chem, 1987, 59(8):1230～1232.

[3]Smith R D, Olivares J A, Nguyen N T, et al.Capillary zone electrophoresis-mass spectrometry using an electrospray ionization interface [J]. Anal Chem, 1988, 60 (5):436～441.

[4]Smith R D, Udseth H R. Capillary zone electrophoresis-MS [J]. Nature (London), 1988, 331: 639～640.

[5]Smith R D, Barinaga C J, Udseth H R. Improved electrospray ionization interface for capillary zone electrophoresis-mass spectrometry [J]. Anal Chem, 1988, 60 (18): 1948～1952.

[6]Cheng Y F, Dovichi N J. Subattomole amino acid analysis by capillary zone electrophoresis and laser-induced fluorescence [J]. Science, 1988, 242(4878): 562～564.

[7]Wallingford R A, Ewing A G. Capillary zone electrophoresis with electrochemical detection in 12.7 .mu.m diameter columns [J]. Anal Chem, 1988, 60 (18): 1972～1975.

[8]Chen C Y, Morris M D. Raman Spectroscopic Detection System for Capillary Zone Electrophoresis [J]. Appl Spectrosc, 1988, 42(3): 513～515.

[9]Huang X H, Teng K, Pang J, et al.On-column conductivity detector for capillary zone electrophoresis [J]. Anal Chem, 1987,59 (23): 2747～2749.

[10]Kuhr W G, Yeung E S. Indirect fluorescence detection of native amino acids in capillary zone electrophoresis [J]. Anal. Chem., 1988, 60 (17): 1832～1834.

[11]魏國芬，寇文杰，葉 泰，等.光纖光譜方法快速檢測尿液中的有機(jī)磷農(nóng)藥生物標(biāo)志物[J]．湖北師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版), 2011, 3(31): 60～64.

[12]Benhabib M, Chiesl T N, Stockton A M.et al. Multichannel Capillary Electrophoresis Microdevice and Instrumentation for in Situ Planetary Analysis of Organic Molecules and Biomarkers [J]. Anal. Chem., 2010, 82 (6): 2372～2379.

[13]Meighan M M, Keebaugh M W, Quihuis A M, et al.Electrophoretic exclusion for the selective transport of small molecules [J]. Electrophoresis, 2009, 30(21): 3786～3792.

[14]Meighan M M,Vasquez J, Dziubcynski L,et al. Investigation of Electrophoretic Exclusion Method for the Concentration and Differentiation of Proteins [J]. Anal. Chem., 2011, 83(1): 368～373.

[15]Kenyon S M, Weiss N G, Hayes M A. Using electrophoretic exclusion to manipulate small molecules and particles on a microdevice [J]. Electrophoresis, 2012, 33(8): 1227～1235.

[16]Munns R K, Holland D C, Roybal J E, et al. Liquid chromatographic determination of methylene blue and its metabolites in milk [J]. Journal of AOAC International, 1992, 75(5):796～800.

[17]Bhasikuttan A C, Sapre A V, Shastri L V. Oxidation of crystal violet and malachite green in aqueous solutions-a kinetic spectrophotometric study[J]. Journal of Photochemistry and photobiology A: Chemistry, 1995, 90(2): 177～182.

[18]Foret F,Deml M, Kahle V, et al.On-line fiber optic UV detection cell and conductivity cell for capillary zone electrophoresis [J], Electrophoresis, 1986, 7(9): 430～432.

[19]肖虎鵬，周小理，韓 生，等．CE-UV-Vis法測定鯽魚中結(jié)晶紫[J]．化學(xué)世界, 2012, (1): 19～23.

Detectionofcrystalvioletbycapillaryelectrophoresis-fiberopticspectrometer

HAN Yun, WEI Guo-fen, ZHANG Xia,LIAN Pan-pan, WANG Jin-li, LV Jian-quan

(Hubei Key Laboratory of Pollutant Analysis & Reuse Technology,Hubei Normal University, Huangshi 435002, China)

A novel method for the determination of crystal violet (CV) has been developed based the capillary electrophoresis - fiber optic spectrometer system. The conditions for the system and analysis of CV are experimentally investigated. The optimum conditions are as follow: mobile phase, 0.1 mol/L H3PO4-NaH2PO4buffer solution (pH 4.0), detection wavelength at 590nm in the visible region, separation voltage 3000V, and injection time 60s. Under the optimum conditions, the absorbance is proportional linearly to CV concentration in the range of 3 and 10 μg/mL, the correlation coefficient is 0.9954, and the detection limit was 0.8 μg/mL. This method has been successfully applied in rapid detection of CV.

detection; crystal violet; capillary electrophoresis; fiber optic spectrometer

2014—01—27

韓韻(1988— ),男，湖北省丹江口市人，碩士生，研究方向為基礎(chǔ)研究.

O657.8

A

1009-2714(2014)02- 0088- 05

10.3969/j.issn.1009-2714.2014.02.020