徐廷滔,白忠義，龍朋朋，張 攀，于保東

(1.吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春130062；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033)

申克氏孢子絲菌(Sporothrixschenckii)是雙相型病原真菌，在自然條件下表現(xiàn)為菌絲相，而在體內(nèi)和37℃為酵母相。申克氏孢子絲菌引起人和動物的皮膚、皮下組織及其附近淋巴系統(tǒng)的慢性感染，稱之為孢子絲菌病(Sporotrichosis)[1]。該病常常與皮膚的輕微外傷后接觸被病原菌污染的物質(zhì)有關(guān)。臨床上孢子絲菌病分為淋巴管型、固定型及播散型。其中最常見的是淋巴管型，引起皮膚滲出、化膿，甚至潰爛。其次是固定型，常引起面部皮疹，多見于兒童。雖然播散型孢子絲菌病發(fā)生率不高，但該病如不及時治療，可引起死亡[2]。近年來，隨著抗腫瘤藥物、抗生素等的廣泛應(yīng)用，以及惡性血液病和艾滋病等免疫受損人群的不斷擴(kuò)大，播散型孢子絲菌病呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康[3]。

隨著后基因組時代的到來，迫切需要了解大量未知基因的功能。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入突變技術(shù)是通過反向遺傳學(xué)研究基因功能的重要方法,在多種植物及真菌中已獲得大量T-DNA插入突變體[4-6]。而T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的克隆是鑒定突變基因的關(guān)鍵步驟。熱不對稱交錯PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)由Liu和Whittier首先研究并報(bào)道[6]。TAIL-PCR以基因組DNA為模板，利用低退火溫度的簡并引物和高退火溫度的特異性嵌套引物，通過低特異性PCR和高特異性PCR交替的三輪溫度不對稱循環(huán)，擴(kuò)增獲得特異性產(chǎn)物。由于TAIL-PCR具有操作簡單、快速、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，成為克隆已知序列側(cè)翼的常用方法。

目前，對申克氏孢子絲菌分子生物學(xué)研究剛剛起步，要深入了解其致病機(jī)制，需要對相關(guān)基因進(jìn)行分離和分析。本研究以申克氏孢子絲菌T-DNA插入突變株為材料，利用TAIL-PCR方法分離突變菌株T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，為進(jìn)一步挖掘申克氏孢子絲菌的功能基因，在分子水平上探討相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌株

申克氏孢子絲菌(S.schenckii)野生型及T-DNA插入突變菌株Ss1-Ss5由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院提供。

1.2 引物

本研究所用引物見表1，其中T-DNA-R和T-DNA-F為擴(kuò)增T-DNA(left border -trpC-hph-right border)引物；LB1，LB2，LB3為TAIL-PCR左邊界嵌套引物；RB1，RB2，RB3為TAIL-PCR右邊界嵌套引物；AD1，AD2，AD3，AD4為隨機(jī)引物，上述引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 本研究所用引物

2 方法

2.1 申克氏孢子絲菌基因組DNA的提取

將申克氏孢子絲菌野生型和突變菌株(Ssl-Ss5)接種于5 ml PDB(potato dextrose broth)培養(yǎng)基，于28℃，100 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。挑取培養(yǎng)的菌絲體，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管內(nèi)，10 000 r/min 離心1 min，收集菌絲體，參照文獻(xiàn)提供的方法提取孢子絲菌基因組DNA[8,9]。

2.2 T-DNA插入突變體的PCR 驗(yàn)證

利用提取的基因組DNA，以野生型申克氏孢子絲菌為陰性對照，PCR擴(kuò)增突變菌株(Ssl-Ss5)的T-DNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃,2 min后進(jìn)入循環(huán)程序：94℃,30 s；53℃,30 s；72℃，1 min，共30個循環(huán)，最后，于72℃延伸10 min[10]。

2.3 TAIL-PCR分離突變體T-DNA側(cè)翼序列

根據(jù)T-DNA插入載體pBHt1上的T-DNA序列設(shè)計(jì)左邊界和右邊界兩套TAIL-PCR特異性嵌套引物L(fēng)B1、LB2、LB3和RB1、RB2、RB3，同時設(shè)計(jì)四條隨機(jī)簡并引物AD1～AD4，TAIL-PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件見表2和表3。TAIL-PCR是基于簡并引物和特異引物的熱不對稱循環(huán)，分為三輪反應(yīng)：第一輪PCR包括5次高特異性循環(huán)、1次低特異性循環(huán)、10次較低特異性循環(huán)和15次熱不對稱循環(huán)；第二輪PCR是以第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋50倍作為模板，通過15次熱不對稱循環(huán)，使特異產(chǎn)物選擇性放大，而非特異性的產(chǎn)物降到極低的濃度；第三輪PCR又將第二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋50倍作為模板，再通過30次熱不對稱循環(huán)，使特異產(chǎn)物進(jìn)一步得到放大。通過三輪PCR反應(yīng)即可獲得T-DNA鄰近的側(cè)翼序列。TAIL-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。TAIL-PCR產(chǎn)物回收后，以RB-3或LB-3作為引物，送北京英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

表2 TAIL-PCR反應(yīng)體系的組成

3 結(jié)果

3.1 T-DNA插入突變株Ss1-Ss5分子鑒定

根據(jù)申克氏孢子絲菌突變菌株Ss1-Ss5中T-DNA(left border -trpC-hph- right border)左臂、右臂設(shè)計(jì)特異性引物T-DNA-F和T-DNA-R(兩者之間片段大小為2 100 bp)，對突變菌株進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果從這5株突變體中均擴(kuò)增出一條大小約2 100 bp的條帶，而野生菌株無特異性條帶，表明T-DNA已整合到申克氏孢子絲菌Ss1-Ss5基因組中(見圖1)。

表3 TAIL-PCR反應(yīng)程序

*，**，***和****分別代表5，10，15和30個循環(huán)。

3.2 T-DNA插入突變株側(cè)翼序列的分離

取TAIL-PCR的第二輪和第三輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果這五株突變體，在第二輪擴(kuò)增時均獲得2-3條PCR產(chǎn)物條帶，特異性較差；經(jīng)過第三輪擴(kuò)增后，獲得大小為300 bp左右的特異條帶，且第三輪PCR產(chǎn)物比第二輪PCR產(chǎn)物小100 bp左右(見圖2)。產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒純化后進(jìn)行測序。序列分析表明，利用TAIL-PCR從五株突變株中均獲得申克氏孢子絲菌T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，且側(cè)翼序列之間無同源性(見圖3)。

4 討論

T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的克隆是分離功能基因的關(guān)鍵步驟。目前已建立了幾種用于克隆T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的方法，如接頭連接介導(dǎo)PCR、反向PCR、質(zhì)粒營救及TAIL-PCR等[11,12]。而由Whitter和Liu等首先研究并報(bào)道的TAIL-PCR是利用嵌套的特異引物和簡并引物組合，以基

因組DNA作為模板，利用引物長度和特異性的差異設(shè)計(jì)不對稱的溫度循環(huán)，然后通過三輪反應(yīng)來擴(kuò)增特異性的目標(biāo)產(chǎn)物，獲得已知序列的側(cè)翼序列[7]。

利用TAIL-PCR擴(kuò)增側(cè)翼序列與其它方法相比具有如下優(yōu)點(diǎn)[13]:首先TAIL-PCR直接以基因組DNA為模板篩選目標(biāo)序列，可快速獲得目標(biāo)片段。操作簡單、快速，省去了酶切、連接、加尾等繁瑣步驟。其次，TAIL-PCR技術(shù)不涉及連接反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定，重復(fù)性好，準(zhǔn)確可靠。另外，接頭連接介導(dǎo)PCR、反向PCR等方法均需要DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶及對引物進(jìn)行特殊修飾，而TAIL-PCR只需特異引物和簡并引物，降低實(shí)驗(yàn)成本。

本實(shí)驗(yàn)采用TAIL-PCR技術(shù)，從5株申克氏孢子絲菌突變體中克隆到T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TAIL-PCR是簡單、快速、高效分離申克氏孢子絲菌T-DNA側(cè)翼序列的有效方法，為深入挖掘申克氏孢子絲菌的功能基因，探討雙相型原真菌的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Alexandro Bonifaz,Denisse Vázquez-González.Diagnosis and Treatment of Lymphocutaneous Sporotrichosis:What Are the Options[J].Current Fungal Infection Reports，2013,7(3):252.

[2]Luisa HM Miranda,Fátima Concei?o-Silva,Leonardo P.Quintella,et al.Feline sporotrichosis:Histopathological profile of cutaneous lesions and their correlation with clinical presentation[J].Microbiology and Infectious Diseases，2013,36(4):425.

[3]Silva-Vergara ML,Maneira FR,De Oliveira RM,et al.Multifocal sporotrichosis with meningeal involvement in a patient with AIDS[J].Med Mycol，2005,43,187.

[4]Maruthachalam K,Klosterman SJ,Kang S,et al.Identification of Pathogenicity-Related Genes in the Vascular Wilt Fungus Verticillium dahliae by Agrobacterium tumefaciens-Mediated T-DNA Insertional Mutagenesis[J].Molecular Biotechnology，2011,49(3)：209.

[5]Huser A,Takahara H,Schmalenbach,et al.Discovery of pathogenicity genes in the crucifer anthracnose fungus Colletotrichum higginsianum,using random insertional mutagenesis[J].Mol Plant Microbe Interact，2009,22,143.

[6] Zhang Y， Li G，He D,et al.Efficient insertional mutagenesis system for the dimorphic pathogenic fungus Sporothrix schenckii using Agrobacterium tumefaciens[J].J Microbiol Methods,2011,84,418.

[7] Liu YG,Robert F Whitter.Thermal asymmetric interlaced PCR:automatable amplification and sequencing of insert end fragment from P1 and YAC clones for chromosome walking[J].Genomics,1995,25:674.

[8]Zhang YJ,Zhang S,Liu XZ,et al.A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains[J].Letters in applied microbiology,2010,51(1):114.

[9]Xiaoyan Qu,Baodong Yu,Jinliang Liu,et al.MADS-Box Transcription Factor SsMADS Is Involved in Regulating Growth and Virulence in Sclerotinia sclerotiorum[J].Int J Mol Sci,2014,15:8049.

[10]Sun L,Yan M,Ding Z,et al.Improved dominant selection markers and co-culturing conditions for efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Ustilago scitaminea[J].Biotechnology letters,2014,1:6.

[11] Erster O,Liscovitch M.A modified inverse PCR procedure for insertion,deletion,or replacement of a DNA fragment in a target sequence and its application in the ligand interaction scan method for generation of ligand-regulated proteins[J].Methods Mol Biol,2010,634:157.

[12]O'Malley RC,Alonso JM,Kim CJ,et al.An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome[J].Nat Protoc.2007,2:2910.

[13] Reimer L C,Spura J,Schmidt-Hohagen K,et al.High-Throughput Screening of a Corynebacterium glutamicum Mutant Library on Genomic and Metabolic Level[J].PloS one,2014,9(2):e86799.