★ 李艷 胡蓉 王麗靜 漆小勇 曾憲儀
(1.江西省藥物研究所 江西 南昌 330029,2.江西遠(yuǎn)健藥業(yè)有限公司 江西 南昌 330100)
蒺藜為蒺藜科植物蒺藜(TribulusterrestrisL.)的干燥果實(shí),蒺藜總皂苷是從蒺藜中提取出來(lái)的甾體皂苷,甾體皂苷是蒺藜的主要有效成分,一般為呋甾醇(furostomol)和螺甾醇(spirostanol)兩類[1],臨床上用于治療缺血性心腦血管疾病,為藥物“心腦舒通膠囊”的原料,即用蒺藜地上部位提取總皂苷。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蒺藜的研究方向主要集中在改善性能力強(qiáng)壯作用以及心腦血管等領(lǐng)域[2-4],且已顯示出良好的應(yīng)用前景?!靶哪X舒通膠囊”質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中蒺藜總皂苷的含量測(cè)定方法為氯化鈷作對(duì)照進(jìn)行含量測(cè)定,經(jīng)試驗(yàn)比較氯化鈷溶液與供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)不一致,為了更好的控制蒺藜總皂苷的質(zhì)量,我們從蒺藜總皂苷中分離得到26-O-β-D-吡喃葡萄糖-(25R)-5α-呋甾烷-20(22)-烯-2α,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷,并以此為對(duì)照品,采用分光光度法對(duì)蒺藜總皂苷進(jìn)行含量測(cè)定。
1.1 儀器 島津UV2550紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);電子天平(瑞士Mettler公司M3型)。
1.2 試藥 蒺藜總皂苷(江西遠(yuǎn)健藥業(yè)有限公司提供)。對(duì)照品:26-O-β-D-吡喃葡萄糖-(25R)-5α-呋甾烷-20(22)-烯-2α,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷,含量>98%(簡(jiǎn)稱化合物Ⅱ?qū)φ掌?,下?,由本單位自制。對(duì)二甲氨基苯甲醛、鹽酸、硫酸均為分析純。
2.1 對(duì)照品溶液的制備 取化合物Ⅱ?qū)φ掌愤m量,精密稱定,加70%乙醇制成每1mL中含0.2mg的溶液,即得。
2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液0.3,0.5,0.7,0.9,1.0mL,分別置具塞試管中,揮去溶劑,放冷,分別加入E試劑(2g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于50mL濃鹽酸中,加50mL水稀釋即得。)5mL,置40℃水浴中加熱5min,立即取出,于冰水浴中冷卻后,加入硫酸乙醇溶液(10→100)5mL,搖勻,放置30min后,立即測(cè)定,以試劑同法操作的溶液為空白。照分光光度法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VB),在520nm±1nm的波長(zhǎng)處于,以吸光度為縱坐標(biāo),對(duì)照品量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.3 測(cè)定法 取供試品6mg,精密稱定,用70%乙醇溶解制成每1mL中含0.24mg的溶液(必要時(shí)超聲處理),作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1mL,置具塞試管中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法,自“揮去溶劑”起,依法測(cè)定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含蒺藜皂苷對(duì)照品的重量,計(jì)算,即得。
2.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別取化合物Ⅱ?qū)φ掌泛洼疝伎傇碥展┰嚻?,照上法制備成溶液,?00~600nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描,測(cè)得二者的最大吸收波長(zhǎng)均為520nm,故選擇520nm±1nm為測(cè)定波長(zhǎng),見圖1。
圖1 化合物Ⅱ?qū)φ掌泛凸┰嚻返膾呙鑸D1、供試品;2、蒺藜皂苷對(duì)照品
2.5 顯色劑的選擇[5,6]為考察最佳顯色劑,參考心腦舒通膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法及呋甾皂苷與E試劑顯色反應(yīng)原理,考察了使用香草醛、E試劑、對(duì)二甲氨基苯甲醛等不同顯色方法的效果,其方法分別為:
A:取供試品溶液及對(duì)照品溶液適量,揮去溶劑,加入新鮮配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8mL,搖勻,置70℃水浴中加熱15min,立即取出,置冰水浴中冷卻后,加入5mL冰醋酸,搖勻;
B:取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量,揮去溶劑,加入E試劑10mL,搖勻;
C:取供試品溶液及對(duì)照品溶液適量,加入改良對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液5mL,密塞,搖勻:置58±2℃水浴中加熱2小時(shí),迅即冷卻至室溫,加入硫酸乙醇溶液5mL,搖勻;
D:本方法。
結(jié)果,A、B方法,供試品與對(duì)照品在400~700nm掃描,供試品與對(duì)照品二者最大吸收波長(zhǎng)不同,且圖形差異較大。C方法,加入硫酸乙醇溶液后不顯色。D方法,供試品與對(duì)照品在400~700nm掃描,二者最大吸收波長(zhǎng)一致,且圖形相似性好見圖1。
2.6 加熱時(shí)間的考察 取蒺藜皂苷對(duì)照品和蒺藜總皂苷供試品,按上述方法,加E試劑后,在40℃水浴加熱不同的時(shí)間,立即取出,于冰水浴中冷卻后,加入硫酸乙醇溶液(10→100)5mL,搖勻,考察顯色后吸收度的變化情況,結(jié)果以加熱5min顯色為高。
2.7 顯色后的穩(wěn)定性考察 取化合物Ⅱ?qū)φ掌泛凸┰嚻罚丈鲜龇椒ㄖ瞥扇芤?,顯色后,在不同的時(shí)間測(cè)定其吸收度,結(jié)果表明,樣品吸收度呈下降趨勢(shì),但在30~45min內(nèi)趨于平穩(wěn)。故選在顯色后30~45min進(jìn)行測(cè)定。
2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 結(jié)果表明,化合物Ⅱ?qū)φ掌吩?.06~0.2mg的范圍內(nèi)線性良好,回歸方程為Y=3.48X-0.13,相關(guān)系數(shù)r=0.9992(n=5)。
2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批樣品取5份,制成供試品溶液,分別取1mL置5支具塞試管中,揮去溶劑,照前法操作測(cè)定,計(jì)算得平均含量為46.85%,RSD為0.83%。表明重復(fù)性較好。
表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果
2.10 回收率試驗(yàn) 取已知含量的蒺藜總皂苷,加入一定量的化合物Ⅱ?qū)φ掌?,按上述方法測(cè)定吸收度,計(jì)算平均回收率為97.28%,RSD為1.5%,結(jié)果見表1。
2.11 樣品測(cè)定 取蒺藜總皂苷三批,按上述測(cè)定法測(cè)定,結(jié)果見表2。
表2 蒺藜總皂苷樣品測(cè)定結(jié)果
3.1 對(duì)照品的選擇 蒺藜總皂苷的含量測(cè)定方法最早來(lái)源于心腦舒通膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),是用氯化鈷做對(duì)照,經(jīng)比較氯化鈷溶液和供試品溶液最大吸收波長(zhǎng)不一致,計(jì)算方法繁瑣,為更好的準(zhǔn)確的控制蒺藜總皂苷的質(zhì)量,我們從蒺藜總皂苷中分離得到一單體化合物作為對(duì)照品,其溶液和供試品溶液顯色后在400~600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,二者圖譜相近,最大吸收波長(zhǎng)一致,可作為對(duì)照品檢測(cè)蒺藜總皂苷的含量。
3.2 顯色試劑和反應(yīng)溫度的選擇 參考心腦舒通膠囊的標(biāo)準(zhǔn)方法及呋甾皂苷與E試劑顯色反應(yīng)原理,考察了香草醛、對(duì)二甲氨基苯甲醛等不同顯色方法的顯色效果,均不太理想,回收率都達(dá)不到要求。實(shí)驗(yàn)中受薄層鑒別研究啟發(fā),薄層板通過(guò)E試劑顯色后,再噴以硫酸乙醇溶液,發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)在高溫天氣下不需加熱就能清晰的顯現(xiàn)。于是我們選擇E試劑加硫酸乙醇溶液作為反應(yīng)試劑。反應(yīng)溫度定為40℃。
3.3 本方法采用蒺藜中的單體皂苷成分作為對(duì)照品,反應(yīng)過(guò)程可控,可操作性強(qiáng),用來(lái)檢測(cè)蒺藜總皂苷的含量準(zhǔn)確可靠,具有創(chuàng)新性。
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