★ 李艷 胡蓉 王麗靜 漆小勇 曾憲儀

(1.江西省藥物研究所 江西 南昌 330029，2.江西遠(yuǎn)健藥業(yè)有限公司 江西 南昌 330100)

蒺藜為蒺藜科植物蒺藜(TribulusterrestrisL.)的干燥果實(shí)，蒺藜總皂苷是從蒺藜中提取出來(lái)的甾體皂苷,甾體皂苷是蒺藜的主要有效成分,一般為呋甾醇(furostomol)和螺甾醇(spirostanol)兩類[1]，臨床上用于治療缺血性心腦血管疾病，為藥物“心腦舒通膠囊”的原料，即用蒺藜地上部位提取總皂苷。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蒺藜的研究方向主要集中在改善性能力強(qiáng)壯作用以及心腦血管等領(lǐng)域[2-4]，且已顯示出良好的應(yīng)用前景?！靶哪X舒通膠囊”質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中蒺藜總皂苷的含量測(cè)定方法為氯化鈷作對(duì)照進(jìn)行含量測(cè)定，經(jīng)試驗(yàn)比較氯化鈷溶液與供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)不一致，為了更好的控制蒺藜總皂苷的質(zhì)量，我們從蒺藜總皂苷中分離得到26-O-β-D-吡喃葡萄糖-(25R)-5α-呋甾烷-20(22)-烯-2α,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷，并以此為對(duì)照品，采用分光光度法對(duì)蒺藜總皂苷進(jìn)行含量測(cè)定。

1 器材與試劑

1.1 儀器 島津UV2550紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；電子天平(瑞士Mettler公司M3型)。

1.2 試藥 蒺藜總皂苷(江西遠(yuǎn)健藥業(yè)有限公司提供)。對(duì)照品：26-O-β-D-吡喃葡萄糖-(25R)-5α-呋甾烷-20(22)-烯-2α,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷，含量>98%(簡(jiǎn)稱化合物Ⅱ?qū)φ掌?，下?，由本單位自制。對(duì)二甲氨基苯甲醛、鹽酸、硫酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 取化合物Ⅱ?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加70%乙醇制成每1mL中含0.2mg的溶液，即得。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液0.3，0.5，0.7，0.9，1.0mL，分別置具塞試管中，揮去溶劑，放冷，分別加入E試劑(2g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于50mL濃鹽酸中，加50mL水稀釋即得。)5mL，置40℃水浴中加熱5min，立即取出，于冰水浴中冷卻后，加入硫酸乙醇溶液(10→100)5mL，搖勻，放置30min后，立即測(cè)定，以試劑同法操作的溶液為空白。照分光光度法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VB)，在520nm±1nm的波長(zhǎng)處于，以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 測(cè)定法 取供試品6mg，精密稱定，用70%乙醇溶解制成每1mL中含0.24mg的溶液(必要時(shí)超聲處理)，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1mL，置具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“揮去溶劑”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含蒺藜皂苷對(duì)照品的重量，計(jì)算，即得。

2.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別取化合物Ⅱ?qū)φ掌泛洼疝伎傇碥展┰嚻?，照上法制備成溶液，?00～600nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，測(cè)得二者的最大吸收波長(zhǎng)均為520nm，故選擇520nm±1nm為測(cè)定波長(zhǎng)，見圖1。

圖1 化合物Ⅱ?qū)φ掌泛凸┰嚻返膾呙鑸D1、供試品；2、蒺藜皂苷對(duì)照品

2.5 顯色劑的選擇[5,6]為考察最佳顯色劑，參考心腦舒通膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法及呋甾皂苷與E試劑顯色反應(yīng)原理，考察了使用香草醛、E試劑、對(duì)二甲氨基苯甲醛等不同顯色方法的效果，其方法分別為：

A：取供試品溶液及對(duì)照品溶液適量，揮去溶劑，加入新鮮配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL、高氯酸0.8mL，搖勻，置70℃水浴中加熱15min，立即取出，置冰水浴中冷卻后，加入5mL冰醋酸，搖勻;

B：取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，揮去溶劑，加入E試劑10mL，搖勻;

C：取供試品溶液及對(duì)照品溶液適量，加入改良對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液5mL，密塞，搖勻：置58±2℃水浴中加熱2小時(shí)，迅即冷卻至室溫，加入硫酸乙醇溶液5mL，搖勻；

D：本方法。

結(jié)果，A、B方法，供試品與對(duì)照品在400～700nm掃描，供試品與對(duì)照品二者最大吸收波長(zhǎng)不同，且圖形差異較大。C方法，加入硫酸乙醇溶液后不顯色。D方法，供試品與對(duì)照品在400～700nm掃描，二者最大吸收波長(zhǎng)一致，且圖形相似性好見圖1。

2.6 加熱時(shí)間的考察 取蒺藜皂苷對(duì)照品和蒺藜總皂苷供試品，按上述方法，加E試劑后，在40℃水浴加熱不同的時(shí)間，立即取出，于冰水浴中冷卻后，加入硫酸乙醇溶液(10→100)5mL，搖勻，考察顯色后吸收度的變化情況，結(jié)果以加熱5min顯色為高。

2.7 顯色后的穩(wěn)定性考察 取化合物Ⅱ?qū)φ掌泛凸┰嚻罚丈鲜龇椒ㄖ瞥扇芤?，顯色后，在不同的時(shí)間測(cè)定其吸收度，結(jié)果表明，樣品吸收度呈下降趨勢(shì)，但在30～45min內(nèi)趨于平穩(wěn)。故選在顯色后30～45min進(jìn)行測(cè)定。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 結(jié)果表明，化合物Ⅱ?qū)φ掌吩?.06～0.2mg的范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為Y=3.48X-0.13，相關(guān)系數(shù)r=0.9992(n=5)。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批樣品取5份，制成供試品溶液，分別取1mL置5支具塞試管中，揮去溶劑，照前法操作測(cè)定，計(jì)算得平均含量為46.85%，RSD為0.83%。表明重復(fù)性較好。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 回收率試驗(yàn) 取已知含量的蒺藜總皂苷，加入一定量的化合物Ⅱ?qū)φ掌?，按上述方法測(cè)定吸收度，計(jì)算平均回收率為97.28%，RSD為1.5%，結(jié)果見表1。

2.11 樣品測(cè)定 取蒺藜總皂苷三批，按上述測(cè)定法測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 蒺藜總皂苷樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 對(duì)照品的選擇 蒺藜總皂苷的含量測(cè)定方法最早來(lái)源于心腦舒通膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，是用氯化鈷做對(duì)照，經(jīng)比較氯化鈷溶液和供試品溶液最大吸收波長(zhǎng)不一致，計(jì)算方法繁瑣，為更好的準(zhǔn)確的控制蒺藜總皂苷的質(zhì)量，我們從蒺藜總皂苷中分離得到一單體化合物作為對(duì)照品，其溶液和供試品溶液顯色后在400～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，二者圖譜相近，最大吸收波長(zhǎng)一致，可作為對(duì)照品檢測(cè)蒺藜總皂苷的含量。

3.2 顯色試劑和反應(yīng)溫度的選擇 參考心腦舒通膠囊的標(biāo)準(zhǔn)方法及呋甾皂苷與E試劑顯色反應(yīng)原理，考察了香草醛、對(duì)二甲氨基苯甲醛等不同顯色方法的顯色效果，均不太理想，回收率都達(dá)不到要求。實(shí)驗(yàn)中受薄層鑒別研究啟發(fā)，薄層板通過(guò)E試劑顯色后，再噴以硫酸乙醇溶液，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)在高溫天氣下不需加熱就能清晰的顯現(xiàn)。于是我們選擇E試劑加硫酸乙醇溶液作為反應(yīng)試劑。反應(yīng)溫度定為40℃。

3.3 本方法采用蒺藜中的單體皂苷成分作為對(duì)照品，反應(yīng)過(guò)程可控，可操作性強(qiáng)，用來(lái)檢測(cè)蒺藜總皂苷的含量準(zhǔn)確可靠，具有創(chuàng)新性。

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