★ 嵇琴 彭淑紅 張敏 孫振 章明 朱衛(wèi)豐*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江西 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心 江西 南昌 330004；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江西 南昌 330004)

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，一般認(rèn)為基因調(diào)控元件(如啟動(dòng)子)的CpG中發(fā)生5mC的修飾，會(huì)在空間阻礙轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與DNA結(jié)合，因此，DNA甲基化一般與基因沉默相關(guān)聯(lián)[1]。盡管有研究報(bào)道中藥對(duì)DNA甲基化修飾有影響[2]，但是鮮有文獻(xiàn)從中藥四性角度闡述中藥與DNA的甲基化的關(guān)系。中藥四性是中藥藥性理論的重要組成部分，它是指寒熱溫涼四種藥性，寒涼與溫?zé)崾潜举|(zhì)不同，互相對(duì)立的兩種藥性。凡能消除或減輕熱性病證的藥物，性屬寒涼；凡能消除或減輕寒性病證的藥物，性屬溫?zé)?。此外，中藥藥性理論認(rèn)為還存在平性藥物，是指寒熱之性不甚明顯，作用比較緩和的一類藥物。因此，本文就從中藥的寒涼、溫?zé)峒捌叫缘慕嵌?，綜述不同藥性對(duì)DNA甲基化修飾的影響，以探尋藥性與DNA甲基化修飾之間的關(guān)系。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化是最早被發(fā)現(xiàn)與基因抑制相關(guān)的表觀遺傳機(jī)制，它在維持正常細(xì)胞功能、胚胎發(fā)育、遺傳印記、以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用,是目前新的研究熱點(diǎn)之一。它由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA-methyl transferase, DNMT)催化，利用 S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基供體，將胞嘧啶的第五位碳原子甲基化，從而使胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5甲基胞嘧啶(5mC)。哺乳動(dòng)物中 DNMT 家族總共有5個(gè)成員，分別是DNMT3A、DNMT3B 、DNMT1、DNMT2和 DNMT3L，但只有 DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B這3種酶有甲基轉(zhuǎn)移活性[3]。越來(lái)越多的研究表明中藥可以通過(guò)干預(yù)DNA的甲基化修飾過(guò)程，而發(fā)揮其治療的效果。

2 中藥對(duì)DNA甲基化的影響

2.1 寒涼性中藥對(duì)DNA甲基化的影響 一般來(lái)說(shuō)，寒涼藥具清熱瀉火、清熱利尿、清化熱痰、涼血解毒、滋陰除蒸、瀉熱通便、清心開竅、涼肝熄風(fēng)等作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)四季三黃膠囊(主要由黃芩、黃柏、梔子、大黃等成分組成)可能通過(guò)提高動(dòng)脈粥樣硬化( As)小鼠血清DNA 甲基化水平和DNMTs 水平，從而起到降低血清甘油三酯( TG) 水平，穩(wěn)定As 斑塊的作用[4]。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)蜂膠乙醇提取物(EEP)也能夠提高或保持對(duì)小鼠心肌DNA甲基化水平，可能是因?yàn)镋EP可以減輕自由基對(duì)于甲基化酶的破壞，從而保護(hù)DNA甲基化酶的結(jié)構(gòu)，使DNA甲基化酶空間發(fā)生變構(gòu)，使它更易于向甲基化位點(diǎn)轉(zhuǎn)移甲基，從而提高了DNA甲基化效率，使細(xì)胞延緩衰老[5]。然而苦參堿[6]可以降低整體細(xì)胞DNA甲基化水平從而誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡。

綠茶中的茶多酚以及生物黃酮能抑制DNMT催化的DNA甲基化[7]。天花粉蛋白(trichosanthin，TCS)也具有顯著的去甲基化作用，TCS是葫蘆科植物栝樓的塊根內(nèi)的有效成分，TCS通過(guò)降低DNMTs的活性，對(duì)脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，SYK)基因具有顯著的去甲基化作用，從而抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。

小白菊內(nèi)酯 (Parthenolide) 是中藥野生甘菊的主要提取成分，小白菊內(nèi)酯含有α-亞甲基-γ-內(nèi)酯環(huán)和環(huán)氧化物結(jié)構(gòu)[9]，小白菊內(nèi)酯的γ-亞甲基內(nèi)酯環(huán)通過(guò)烷基化反應(yīng)中的Cys1226巰基的催化結(jié)構(gòu)域硫醇鹽抑制 DNMT1；使 G1期細(xì)胞靜息或干擾轉(zhuǎn)錄因子Sp1與DNMT1啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，下調(diào)DNMT1表達(dá)[10]。

雷公藤甲素(triptolide，TP)又稱雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TL)，是從雷公藤根中分離出的二萜類化合物[11]。HL對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，主要是通過(guò)逆轉(zhuǎn)人惡性淋巴瘤CA46細(xì)胞異常甲基化的p16基因去甲基化[12]。HL可抑制人髓系白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且不同濃度的TL抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依耐性，可能是通過(guò)下調(diào)甲基轉(zhuǎn)移酶基因DNMT1/3B mRNA的表達(dá)，降低LINE-1、DAPK-1基因甲基化程度，使DAPK-1基因表達(dá)上調(diào)實(shí)現(xiàn)的[13]。TP 也可明顯抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA的表達(dá)，抑制P53特別是 P73基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，促進(jìn)P53、P73的表達(dá)，并且能夠抑制MCF-7細(xì)胞的增殖[14]，TP可通過(guò)抑制甲基轉(zhuǎn)移酶使P53基因去甲基化,促進(jìn)P53蛋白的表達(dá),從而抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖[15]，TP還可以逆轉(zhuǎn)Jurkat細(xì)胞apc基因甲基化[16]。 18nM TL處理HT-1080細(xì)胞72小時(shí)后TL通過(guò)上調(diào)DNMT-1和一3A的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)基因的甲基化水平，最終抑制人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞的MMP-9基因的表達(dá)及活性[17]。

2.2 溫?zé)嵝灾兴帉?duì)DNA甲基化的影響 溫?zé)崴幰话憔邷乩锷⒑?、溫?yáng)利水、溫經(jīng)通絡(luò)、補(bǔ)火助陽(yáng)、暖肝散結(jié)、引火歸原、回陽(yáng)救逆等作用。姜黃素(curcumin)是從我國(guó)傳統(tǒng)中藥姜黃根莖中提取的一種植物多酚,它為一種強(qiáng)力的DNA甲基化抑制劑，通過(guò)與DNMT1的分子間的相互作用，抑制DNMT1的活性，從而使基因組整體的甲基化下降而發(fā)揮作用[18]。中濃度40umol/L與高濃度60umol/L姜黃素處理后的SGC-7901細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、HepGZ細(xì)胞的p16基因和MGMT基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化程度下降，表明姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞P16基因和MGMT基因有一定的去甲基化作用[19]。姜黃素也可能上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞回復(fù)引導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白含kazal基元( RECK) 基因表達(dá)，降低RECK甲基化水平，從而抑制 MMP-9 的表達(dá)與活性而發(fā)揮對(duì) CNE-1 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用[20]。

參茸補(bǔ)血丸(由人參、鹿茸、杜仲、巴戟天等藥組成)能促進(jìn)去勢(shì)大鼠生殖器官的發(fā)育，明顯降低肝、腎組織 DNA 甲基化酶活力和DNA甲基化水平，提高對(duì)應(yīng)組織中 RNA 聚合酶活力，能使受損機(jī)體肝、腎組織低甲基化，基因高表達(dá)以代償因切除卵巢帶來(lái)整體效應(yīng)低下[21]。

用補(bǔ)腎益精法軟皮湯方(熟地黃、阿膠、山茱萸、黃芪、山藥、紅花、茯苓等組成)含藥血清干預(yù)硬皮病成纖維細(xì)胞，可減少DNMT1 的表達(dá)[22]。丹參提取物丹參酮ⅡA也可明顯降低DNMT1基因的表達(dá)，且對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞具有顯著的抑制作用[23]。

2.3 平性中藥對(duì)DNA甲基化的影響 樹舌多糖(gapsgf, GF)為樹舌的主要有效成分，應(yīng)用限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)法觀察GF對(duì)小鼠HepA瘤基因組甲基化的影響,發(fā)現(xiàn)GF能明顯提高小鼠HepA瘤基因組甲基化的發(fā)生率，具體的分子機(jī)制尚不清楚，推測(cè)可能具有逆轉(zhuǎn)突變的5mC(T)的作用，可能是通過(guò)抑制癌基因的低甲基化或恢復(fù)基因的功能而實(shí)現(xiàn)的，也可能是通過(guò)使腺昔基蛋氨酸合成酶基因表達(dá)增高、和或使甲基化酶活性增高的作用而實(shí)現(xiàn)的。另外樹舌多糖具有明顯的抗腫瘤作用，且有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，能夠阻滯細(xì)胞周期，使S期細(xì)胞不能進(jìn)入GZ-M期，阻滯于S期[24]。

2.4 藥性不明中藥對(duì)DNA甲基化的影響

2.4.1 抗衰老藥物衰老過(guò)程中DNA 甲基化水平呈下降趨勢(shì)，DNA甲基化酶活力隨大鼠年齡增加而明顯降低，DNA 甲基化酶活性隨衰老而下降[25]。小鼠腦、肝細(xì)胞DNA甲基化酶活力也隨著老鼠年齡的增高而下降，益腎健脾方劑能顯著提高生理性腎虛小鼠肝細(xì)胞甲基化酶的活力，用8.4%的益腎方和15.2%的健脾方喂養(yǎng)成年小鼠和老年(生理性腎虛組)小鼠8周后發(fā)現(xiàn)，給藥各組的小鼠肝、腦細(xì)胞DNA甲基化酶活力均明顯增高，其中對(duì)腦的作用益腎方(成年組增高30%，老年組增高18%)比健脾方(成年組增高21%;老年組增高13%)強(qiáng)；而對(duì)肝的作用健脾方(成年組增高61%，老年組增高63%)則明顯強(qiáng)于益腎方(成年組增高36%，老年組增高35%)[26]。除此之外，小鼠服用一定濃度的茶多酚后，有可能通過(guò)改變DNA甲基化酶的空間構(gòu)象，使其更容易向正常甲基化位點(diǎn)轉(zhuǎn)移甲基，達(dá)到提高DNA 甲基化酶活性的目的，從而發(fā)揮抗衰老的作用[27,28]。神方補(bǔ)腎生血藥(主要由生地、山萸肉、龜版膠、阿膠、枸杞等十余味中藥組成)同樣能明顯提高老齡大鼠肝組織DNA甲基化酶活力和DNA甲基化水平，達(dá)到延緩衰老的作用[29,30],也可顯著提高老齡大鼠腦組織中DNA甲基化酶的活性，從而提高DNA甲基化酶的熱穩(wěn)定性，還可提高大鼠腦DNA甲基化酶對(duì)NaCl的耐受性[31]。

2.4.2 治療腎病藥物中醫(yī)認(rèn)為，腎病是由外邪侵襲，或勞欲過(guò)度，久病耗傷精氣等所致。腎病是一個(gè)很籠統(tǒng)的概念，簡(jiǎn)單地說(shuō)，只要腎臟有病，統(tǒng)統(tǒng)叫腎病。從糖尿病腎病大鼠的胰腺組織中提取基因組DNA，采用甲基化敏感性限制性核酸內(nèi)切酶HpaII和MspI(為一組同裂酶)進(jìn)行限制性酶切，并進(jìn)行染色質(zhì)DNaseI敏感性分析，發(fā)現(xiàn)糖維康(太子參、玄參、黃芪、僵蠶、丹參、水蛭等)治療糖尿病腎病后能向正常方向逆轉(zhuǎn)胰腺組織DNA 中CCGG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)，通過(guò)提高基因轉(zhuǎn)錄水平和向正常方向恢復(fù)甲基化狀態(tài)而發(fā)揮治療糖尿病的作用[32]。慢性腎功能衰竭患者血清同型半胱氨酸水平升高發(fā)生率高達(dá)82.5%，其水平為正常人的2～3倍，尿毒清顆粒(大黃、黃芪、桑白皮、苦參、白術(shù))可以使慢性腎功能衰竭大鼠基因組DNA從低甲基化狀態(tài)恢復(fù)到正常水平[33]，達(dá)到恢復(fù)慢性腎功能衰竭大鼠腎功能的作用。補(bǔ)腎中藥二至天癸顆粒(由女貞子、旱蓮草、枸杞子、菟絲子等組成)在一定程度上也可以糾正Snrpn和Peg1/Mest基因的異常去甲基化，改善腎虛小鼠受精卵卵裂率、囊胚形成率，發(fā)揮治療不孕癥的作用[34]。

2.4.3 治療狼瘡藥物 三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是中藥砒霜的主要成分，它對(duì)MRL/lpr狼瘡鼠有一定的治療作用，作用機(jī)制有可能是通過(guò)升高狼瘡鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞DNMT1基因表達(dá)水平，從而達(dá)到改善狼瘡的DNA低甲基化狀態(tài)的目的[35]。砷劑也能引起 p53 和 p16 基因啟動(dòng)子的高甲基化，并且甲基化程度與砷的劑量呈正相關(guān)[36]，ATO 處理的 MRL/lpr小鼠 CD4+T 細(xì)胞平均甲基化水平與空白對(duì)照組相比有明顯的上升[37]。我國(guó)更有許多實(shí)驗(yàn)證明：ATO 能提高 MRL/lpr狼瘡小鼠的脾臟與淋巴結(jié) DNA 整體甲基化水平[38]，從而下調(diào) IFN-γ和 IL-4 的表達(dá)。有研究采用體外試驗(yàn)給予 ATO 0.4 mg/(kg d) 隔日腹腔注射，證實(shí) ATO 可改善 MRL/lpr自發(fā)性狼瘡小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞的低甲基化狀態(tài)；體內(nèi)試驗(yàn)1 μmol/L ATO 作用 24 h 能在一定程度上有效逆轉(zhuǎn)活化狀態(tài)下 MRL/lpr狼瘡小鼠脾臟 CD4+T 細(xì)胞 IFN-γ基因啟動(dòng)子低甲基化[39]，基于此認(rèn)為 ATO 可能通過(guò)逆轉(zhuǎn) SLE 的低甲基化狀態(tài)，從而治療SLE。

2.4.4 治療胃癌藥物 胃癌居我國(guó)惡性腫瘤死亡率首位[40], 嚴(yán)重威脅人類健康。解毒化瘀健脾方對(duì)異型增生胃黏膜細(xì)胞p16 、PTEN 基因具有一定的去甲基化作用，同時(shí)誘導(dǎo)p16、PTEN蛋白的高表達(dá),對(duì)胃黏膜異型增生具有潛在的治療作用[41]。白藜蘆醇在濃度(0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)以劑量依賴性方式抑制人胃癌SGC-7901 細(xì)胞增殖，且隨著濃度的增加，RASSF1A甲基化的水平逐漸減弱，非甲基化水平逐漸增多。同時(shí)RASSF1A的mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)[42]，白藜蘆醇也能夠顯著改變糖尿病大鼠主動(dòng)脈的細(xì)胞因子基因的甲基化狀態(tài)[43]。以N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG )為主的多因素聯(lián)合攻擊法誘發(fā)的胃癌前病變大鼠檢測(cè)出抑癌基因 E-cadherin、p16 發(fā)生高甲基化及基因c-myc發(fā)生低甲基化，胃寧顆粒(主要成分為黃芪、白花蛇舌草、莪術(shù)、枸杞等)對(duì)E-cadherin 基因甲基化無(wú)相關(guān)作用; 對(duì) p16、c-myc基因甲基化發(fā)生相關(guān)調(diào)控作用[44]。消痰散結(jié)方(有半夏、膽南星、茯苓、枳實(shí)、陳皮、炙甘草等組成)能降低胃癌P16基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平，增加P16基因mRNA的表達(dá),從而有效抑制胃癌細(xì)胞系以及裸鼠原位移植瘤的生長(zhǎng)[45]。

2.4.5 治療乳腺癌藥物乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在婦女僅次于子宮癌，已成為威脅婦女健康的主要病因，二氫楊梅素顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞 PTEN 基因去甲基化，促進(jìn)其表達(dá)，其機(jī)制可能主要涉及對(duì) DNMT1 表達(dá)和活性的抑制[46]。紫杉醇[47]可以降低整體細(xì)胞DNA甲基化水平從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

2.4.6 治療骨髓增生異常綜合征藥物青黃散(由青黛、雄黃組成)通過(guò)抑制DNMTl mRNA的表達(dá)使S-腺苷甲硫氨酸(SAM)向S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的進(jìn)一步代謝減弱，結(jié)果使SAM向DNA提供的甲基基團(tuán)減少，降低了DNA的甲基化，從而改變骨髓增生異常綜合征(MDS)患者高甲基化狀態(tài)起到治療骨髓增生異常綜合征(MDS)作用[48]。

2.4.7 其它 口服蜂王漿對(duì)雄性大、小鼠腦、肝、腎及血液DNA甲基化水平?jīng)]有影響[49]。血府逐瘀膠囊(主要由桃仁、紅花、赤芍、川芎等成分組成)可提高動(dòng)脈粥樣硬化( As)小鼠血清DNA 甲基化水平和DNMTs 水平，從而起到降低血清甘油三酯( TG) 水平，穩(wěn)定As 斑塊的作用[4]。槲皮素可以通過(guò)降低RASSF1A、p16INK4a和Erb基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，從而阻滯細(xì)胞周期停留在G0/G1期[50]。愈肝顆粒(由茵陳、黨參、梔子等13味中藥組成)通過(guò)降低DNMT1、DNMT3A和DNMT3B表達(dá)水平，從而調(diào)整DNA的甲基化狀態(tài)同樣可以起到防治肝癌發(fā)生的作用[51]。

表1 四性中藥與DNA甲基化相關(guān)研究結(jié)果一覽表

3 小結(jié)與展望

中藥四性是中藥藥性的核心，客觀準(zhǔn)確的判別中藥的四性是中藥藥性研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。隨著近年來(lái)人們對(duì)DNA甲基化的研究深入和對(duì)中藥干預(yù)甲基化實(shí)驗(yàn)的逐步展開，該課題組對(duì)DNA甲基化修飾與中藥藥性之間是否有某種聯(lián)系產(chǎn)生了很大的興趣。因此，文章通過(guò)綜述中藥對(duì)DNA甲基化的研究報(bào)道，將其歸納總結(jié)為表1。通過(guò)文獻(xiàn)整理，可以看出：(1)目前報(bào)道的寒涼藥對(duì)DNA全基因組甲基化的作用有升高也有降低；(2)目前報(bào)道的溫?zé)崴幘@示出能降低DNA甲基化酶活力或DNA甲基化水平的作用；(3)平性藥干預(yù)DNA甲基化水平的報(bào)道并不多；(4)對(duì)于DNA甲基化干預(yù)作用中藥，大多藥性不明，不便歸類。

鑒于目前對(duì)于已確定藥性的中藥作用于DNA甲基化的研究并不太多，以及寒熱或溫涼作用的靶點(diǎn)不一，即使同一藥性的中藥作用靶點(diǎn)也不一樣，因此找出DNA甲基化與中藥藥性之間的確切關(guān)系仍面臨種種困難。另外，目前中藥干預(yù)DNA甲基化的研究均是個(gè)別中藥，尚無(wú)針對(duì)寒熱或溫涼藥物與DNA甲基化修飾的系統(tǒng)研究，所以也增加了對(duì)藥性規(guī)律統(tǒng)計(jì)的難度。相信隨著中藥干預(yù)DNA甲基化研究的不斷深入和擴(kuò)展，中藥干預(yù)DNA甲基化的具體靶點(diǎn)和機(jī)制的逐漸明確，以及未來(lái)對(duì)中藥四性與DNA甲基化系統(tǒng)性研究的力度加大將極大促進(jìn)中藥藥性的本質(zhì)闡釋和客觀化判別進(jìn)程。

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