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(貴陽中醫(yī)學(xué)院 貴州 貴陽 550002)

中醫(yī)學(xué)認為膽汁是肝之余氣所化生，肝的主要生理功能是主疏泄。肝的疏泄狀態(tài)在一定程度上影響著膽汁的分泌與排泄，肝疏泄功能正常則膽汁分泌、排泄正常，反之則失常。其次，肝的疏泄功能與情志之間也有著密切的關(guān)系，疏泄太過則煩躁易怒，不及則情志抑郁；反之，情志變化也會影響到肝的疏泄功能。

膽固醇作為膽汁中的主要成分之一，與各種膽病的形成有著密切關(guān)系，因此通過觀察肝失疏泄狀態(tài)下模型動物膽汁中膽固醇濃度的變化規(guī)律，能夠在一定程度上為“膽病從肝論治”提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物與分組 6周齡SPF級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量170～190g，購于解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK-(軍)2012-0003。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其分為正常組、CUMS(慢性不可預(yù)知性應(yīng)激)組和單純束縛組。

1.2 實驗試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 膽固醇ELISA檢測試劑盒，購于昆明騰科科技有限公司。

1.2.2 實驗儀器 止血鉗，手術(shù)刀，膽汁引流管，眼科剪，恒溫水浴箱，-20℃冰箱，-80℃冰箱，離心機，酶標儀。

2 方法

2.1 模型的制備 將24只大鼠隨機分為正常組、CUMS組和單純束縛組，每組8只。

2.1.1 CUMS模型的復(fù)制 每只模型組大鼠均進行單籠孤養(yǎng)。CUMS模型的制備方法：在金光亮等人[1]提出的造模方法基礎(chǔ)上根據(jù)自身實際情況進行操作，將7種刺激(①4℃冷水游泳5min；②45℃熱刺激5min;③12h禁水；④24h禁食；⑤12h晝夜顛倒；⑥行為限制；⑦45min無規(guī)則水平搖晃)隨機安排到21天內(nèi)，每天2種，保證相鄰兩天不重復(fù)同一種刺激。本組動物造模過程中1只大鼠意外死亡。

2.1.2 單純束縛模型 參考唐已婷等人[2]文獻中提到的造模方法,使用鼠籠加報紙?zhí)钊ㄏ拗拼笫蠡顒?3h/d)。

2.3 取材方法 造模21天后取材。用10%水合氯醛按照0.3mL/100g進行腹腔麻醉，將麻醉好的大鼠置于鼠板固定，沿腹正中線切開，找出十二指腸，沿十二指腸找到膽管，分離膽管后在膽管遠端用眼科剪剪一個小口，將膽汁引流管沿小口插入將膽汁引出。計算流出時間，收集半小時內(nèi)流出的膽汁，將其放入凍存管中，于-80℃超低溫冰箱中保存待測。

2.4 指標檢測 采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)定量檢測膽汁中膽固醇含量。

2.4.1 ELISA法檢測膽汁中膽固醇含量 ①將試劑盒平衡至室溫，取出所需反應(yīng)板，分別設(shè)置空白孔(不加樣品和酶標試劑，其余各步驟操作相同)、標準孔、待測樣品孔。②標準孔加入50μL標準品，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL，輕輕混勻30s，封住板孔，37℃溫育30min。③甩盡板內(nèi)液體，將事先用蒸餾水配置好的1∶30(濃縮洗液：蒸餾水)洗滌液洗滌反應(yīng)板(每孔內(nèi)加入350μL洗滌液)，靜置30s甩盡板內(nèi)液體，并去除孔內(nèi)水滴(在厚疊吸水紙上拍干)；反復(fù)洗滌5次。④每孔加入50μL酶標試劑(空白孔除外)，輕輕混勻10s，37℃溫育30min；⑤再用1∶30洗滌液洗滌反應(yīng)板，靜置30s甩盡板內(nèi)液體，并去除孔內(nèi)水滴；反復(fù)洗滌5次。⑥每孔先加入50μL顯色劑A，再加入50μL顯色劑B，輕輕混勻30s，37℃避光顯色10min。⑦每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)在450nm處讀OD值。以O(shè)D值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

3 數(shù)據(jù)處理

4 結(jié)果

CUMS組和單純束縛組膽汁中膽固醇的含量均較正常組膽汁中膽固醇的含量增高,CUMS組與正常組之間存在著顯著性差異(P<0.05)，但是,單純束縛組與正常組之間沒有顯著性差異。模型動物膽固醇含量OD值詳見表1。

表1 膽固醇含量OD值±s)

5 討論

《靈樞·本輸》曰：“肝合膽，膽者，中精之府?！薄稏|寶醫(yī)鑒》指出：“肝之余氣，溢入于膽，聚而成精?！敝嗅t(yī)學(xué)認為，膽汁是“肝之余氣”積聚而成。中醫(yī)學(xué)藏象理論認為，肝具有主疏泄的生理功能，肝與膽相表里，因此肝的疏泄功能在一定程度上與膽汁的分泌和排泄密切相關(guān)；同時肝的疏泄功能也是維持脾胃正常消化功能的重要組成部分。肝疏泄功能正常則膽汁分泌、排泄正常，反之則失常，易造成膽汁的分泌與排泄功能失常，膽汁郁結(jié)；肝膽的氣機不利就容易導(dǎo)致多種相關(guān)疾病的產(chǎn)生。

CUMS造模法和單純束縛造模法是目前常用的影響肝疏泄功能的造模方法。CUMS造模法通過中慢性、低水平、不可預(yù)知的應(yīng)激刺激，較好地模擬了現(xiàn)代社會快節(jié)奏生活下競爭激烈、壓力加重等所導(dǎo)致的抑郁癥，是經(jīng)典的抑郁癥動物模型。而抑郁癥正是肝主疏泄功能失常的表現(xiàn)。單純束縛造模法也是較為成熟的動物肝郁造模法，廣泛用于抑郁癥以及逍遙散干預(yù)作用等實驗研究中，也是可以影響肝的疏泄功能的造模法。故本課題選用CUMS造模法和單純束縛造模法研究在肝失疏泄情況下模型動物膽汁中膽固醇含量的變化，以期明確肝主疏泄功能失常對模型動物膽固醇濃度有無影響。

膽固醇作為一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，廣泛存在于動物體內(nèi)，在腦以及神經(jīng)組織中含量最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中的含量也較高?，F(xiàn)代科學(xué)研究顯示，多種膽病的形成與膽汁中膽固醇含量密切相關(guān)。我國膽囊結(jié)石的發(fā)病率已占膽石病的主要地位，且以膽固醇結(jié)石為主。目前臨床上治療膽石類疾病可以選擇“膽病從肝論治”，這一治療法則有無科學(xué)意義也需要我們進一步明確。

本研究結(jié)果顯示，CUMS組和單純束縛組模型動物膽汁中膽固醇含量均較正常組增高，并且CUMS組模型動物膽汁中膽固醇含量與正常組相比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，單純束縛組與正常組比較其差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，CUMS組和單純束縛組之間比較其差異也沒有統(tǒng)計學(xué)意義。這就在一定程度上說明了肝的疏泄功能失常會影響到膽汁中膽固醇的含量，并使其含量增高。我們知道膽固醇是絕大多數(shù)膽結(jié)石的主要成分，膽汁中膽固醇的過度飽和是膽固醇結(jié)石形成的必要條件。因此我們可以推測，肝的疏泄功能失常造成的膽固醇濃度升高有可能是膽固醇性膽結(jié)石形成的原因之一，也為治療膽石類疾病選擇“膽病從肝論治”提供一定的實驗支持；但是，肝的疏泄功能失常造成的膽固醇濃度升高的具體發(fā)生機制，還有待于進一步深入研究。

[1]金光亮,南睿,郭霞珍.慢性應(yīng)激肝郁大鼠模型的建立[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2003,26(2):18-21.

[2]唐已婷,陳家旭.束縛應(yīng)激與中醫(yī)肝的關(guān)系[J].中國醫(yī)藥學(xué)報,2002,17(2):82-83.