★ 楊海燕 王萍*

(江西中醫(yī)藥大學 江西 南昌 330006)

溫膽湯是中醫(yī)治療痰證的名方，臨床上用于治療肥胖及相關(guān)疾病具有較好療效[1]。以DNA甲基化為代表的表觀遺傳學機制參與了肥胖、心血管疾病、糖尿病、腫瘤等許多復雜疾病的形成和發(fā)展[2]。中醫(yī)是否可以通過干預DNA甲基化狀態(tài)達到調(diào)整機體的作用是很值得探討的問題。脂聯(lián)素(Adiponectin)和低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDLR)均參與脂質(zhì)代謝，與肥胖及相關(guān)疾病的形成有很大關(guān)聯(lián)。本研究即探討溫膽湯對脂聯(lián)素和低密度脂蛋白受體啟動子甲基化狀態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 大鼠肥胖模型制作 選擇SPF級SD雄性大鼠50只，體重(60±10)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2013-0004。大鼠隨機分為兩組，即高脂飼料喂養(yǎng)組(簡稱高脂組)和基礎飼料喂養(yǎng)組(簡稱正常組)，其中高脂組30只，正常組20只。高脂組大鼠從購入起即進行高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飼料由100g基礎飼料中加入豬油15g、蛋黃粉10g、全脂奶粉15g、豬膽鹽0.5及濃縮魚肝油適量組成[3]。各組大鼠分別喂養(yǎng)4周后，淘汰體重過大或過小的大鼠，其中高脂組納入20只，正常組納入10只。高脂組入選大鼠的體重要符合肥胖模型的標準[4]。

1.2 藥物干預 上述大鼠肥胖模型制作成功后，高脂組大鼠隨機分為兩組，每組10只，兩組均停止高脂飼料喂養(yǎng)，采用基礎飼料繼續(xù)喂飼。其中一組高脂組大鼠用溫膽湯灌胃干預1個月(溫膽湯組)，另一組采用飲用水灌胃(模型對照組)。另有正常組10只，也采用飲用水灌胃(正常對照組)。溫膽湯(陳皮10g、法半夏10g、茯苓10g、竹茹10g、炒枳實6g、炙甘草3g、生姜3g、大棗5g)各組成藥物以中藥配方顆粒劑進行配置，由廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)。臨用時把各顆粒劑放入容器中，加熱水溶解，制成1g/mL生藥濃度。溫膽湯劑量采用人臨床生藥折算劑量5.5g/kg的2倍劑量11g/kg。

1.3 DNA提取 溫膽湯干預1個月后，分別處死3組大鼠，獲取腎周脂肪組織提取DNA。DNA提取采用高脂肪組織基因組DNA提取試劑盒(Solar-bti)，提取步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4 DNA甲基化特異性PCR檢測 DNA進行純度檢測合格后，采用EZ DNA Methylation-Gold Kit試劑盒進行亞硫酸氫鈉修飾。然后進行PCR反應與瓊脂糖電泳。DNA甲基化PCR引物設計采用urogene網(wǎng)站在線設計優(yōu)化。

脂聯(lián)素(Adiponectin)甲基化引物參數(shù)為：Left M primer，Start 1798，Size 25，Tm 59.11，GC% 56.00，'C's 5，Sequence TAAAGGTAGGATTTAGGTTTTGTGC；Right M primer，Start 2009，Size 24，Tm 58.61，GC% 54.17，'C's 4，Sequence CTTAAAAACCTCTCAACAAACTCG；Product size:212, Tm:68.9。

Left U primer，Start 1799, Size 25, Tm 59.00, GC% 60.00,'C's 5,Sequence AAAGGTAGGATTTAGGTTTTGTGTG；Right U primer，Start 2009，Size 25，Tm 57.74，GC% 56.00，'C's 4，Sequence CTTAAAAACCTCTCAACAAACTCAC；Product size:211, Tm:68.1。

低密度脂蛋白受體(LDLR)甲基化引物參數(shù)為：Left M primer，Start 660，Size 23，Tm 59.72，GC% 65.22，'C's 5，Sequence TTGTTAAGCGAGGGAGTTGTTAC；Right M primer，Start 849，Size 25，Tm 57.64，GC% 52.00，'C's7，Sequence ACCAAAATTCAATATCAAATATTCG； Product size:190,Tm:59.6。

Left U primer，Start 660，Size 25，Tm 58.27，GC% 64.00，'C's 5，Sequence TTGTTAAGTGAGGGAGTTGTTATGT；Right U primer，Start 847，Size 25，Tm 56.03， GC% 52.00，'C's 6，Sequence CAAAATTCAATATCAAATATTCACC；Product size:188,Tm:59.5。

1.5 統(tǒng)計學方法 計數(shù)資料采用IBM SPSS statistics 19統(tǒng)計軟件進行卡方檢驗。

2 結(jié)果

2.1 DNA質(zhì)量檢測結(jié)果 樣本的DNA純度較好，可以滿足甲基化PCR的要求。DNA純度判斷標準：OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染)。

2.2 脂聯(lián)素啟動子甲基化PCR結(jié)果 分別比較溫膽湯組、模型對照組和正常對照組間腎周脂肪組織脂聯(lián)素啟動子的甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示，大鼠腎周脂肪脂聯(lián)素基因存在著三種甲基化狀態(tài)，即甲基化(M+,U-)、未甲基化(M-,U+)和不完全甲基化(M+,U+)。其中溫膽湯組甲基化3例，非甲基化4例和不完全甲基化3例；模型對照組甲基化5例，非甲基化2例，不完全甲基化3例；正常對照組甲基化2例，非甲基化6例，不完全甲基化2例，見表1。若把甲基化和不完全甲基化同歸為可能的甲基化狀態(tài)，則溫膽湯組甲基化狀態(tài)為6例，模型對照組甲基化狀態(tài)為8例，正常對照組甲基化狀態(tài)為4例，見表2。采用卡方檢驗的fisher精確法檢測結(jié)果顯示，三組間均無統(tǒng)計學差異(P﹥0.05)。

表1 脂聯(lián)素基因啟動子甲基化結(jié)果

表2 三組間脂聯(lián)素基因啟動子甲基化的比較

2.3 大鼠LDLR啟動子區(qū)經(jīng)預測無CpG島，考慮到人的LDLR啟動子區(qū)有CpG島，仍以urogene網(wǎng)站推薦基因甲基化PCR引物進行嘗試研究，未能獲得可信結(jié)果。

3 討論

表觀遺傳學認為，基因啟動子區(qū)的甲基化可能導致基因的表達受抑制[5]。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食導致的大鼠肥胖模型中，與代謝紊亂有關(guān)的基因(如脂聯(lián)素)可能存在著啟動子甲基化狀態(tài)的改變。也就是說，高脂肥胖大鼠模型可能與調(diào)節(jié)代謝的基因表達改變有關(guān)。本研究結(jié)果即表明，脂聯(lián)素在高脂模型中存在著啟動子區(qū)甲基化的趨勢，盡管從統(tǒng)計學上并無顯著性差異，但這一趨勢值得進一步探索。溫膽湯作為中醫(yī)治療痰證的名方，對改善脂質(zhì)代謝紊亂的肥胖具有較好的療效。本研究發(fā)現(xiàn)，溫膽湯可能可以逆轉(zhuǎn)高脂飲食導致的脂聯(lián)素基因啟動子區(qū)甲基化的狀態(tài)，這也可能是其發(fā)揮療效的作用點。大鼠LDLR的啟動子區(qū)雖然沒有發(fā)現(xiàn)CpG島，甲基化的可能性較小。但啟動子區(qū)有時并不僅僅存在于轉(zhuǎn)錄基因之前的序列，也會存在轉(zhuǎn)錄序列之間。所以，高脂飲食導致的肥胖模型是否伴隨著啟動子區(qū)等序列的甲基化狀態(tài)改變，還需要深入研究。更應該注意的是，人類的LDLR啟動子區(qū)是存在著CpG島的，這就需要在臨床研究中去探討此類問題。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，包括脂聯(lián)素和低密度脂蛋白受體等在內(nèi)的諸多基因的甲基化狀態(tài)改變，與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)聯(lián)。如在一項針對動脈粥樣硬化患者的研究中發(fā)現(xiàn)，AS患者存在著低密度脂蛋白受體的甲基化[6]。而肥胖對孕婦的脂聯(lián)素基因的甲基化模式也有影響[7]。

中醫(yī)的病證發(fā)生發(fā)展可能與表觀遺傳學等機制有關(guān)聯(lián)[8]，而中醫(yī)藥干預疾病的機制多樣，對表觀遺傳學機制的影響也可能是其中一環(huán)。但目前這方面的研究報道不多，是值得關(guān)注的領域。

[1]連東輝.加味溫膽湯治療痰濕壅盛型肥胖性高血壓病60例[J].河南中醫(yī),2012,32(7):913-914.

[2]張林,胡茂清.表觀遺傳和肥胖[J].中國糖尿病雜志,2013,21(4):376-378.

[3]王磊,陳虹.幼年雄性SD大鼠營養(yǎng)性肥胖模型的建立[J].中國藥業(yè),2010,19(17):6-7.

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[5]史玉杰,李慶賀,劉曉輝.DNA甲基化與基因表達調(diào)控研究進展[J].中國生物工程雜志,2013,33(7):90-96.

[6]智艷芳,黃彥生,李著華,等.動脈粥樣硬化病人LDL受體基因啟動子序列的高甲基化改變[J].分子細胞生物學報,2007,40(6):419-427.

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[8]王萍,楊海燕,王麗萍,等.從表觀遺傳學開展復雜性疾病證候本質(zhì)的研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(5):1 208-1 210.