★ 劉秀明 羅頌平 馮婷 方家 陳靜靜

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣東 廣州 510405)

壽胎丸源自清代名醫(yī)張錫純的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，由菟絲子、桑寄生、川續(xù)斷和阿膠4味中藥組成，為婦科安胎常用名方，臨床上具有補(bǔ)脾益腎，養(yǎng)血固攝，安胎之功，能有效防治先兆流產(chǎn)。在臨床上，較多學(xué)者選用壽胎丸加減或壽胎丸聯(lián)合西藥治療胎漏、胎動(dòng)不安及滑胎，從目前的報(bào)道來看，有效率均在90%左右，療效確切[1-3]。課題組前期證實(shí)去阿膠的減味壽胎丸具有與壽胎丸基本相同的安胎效果，明確了該方最佳藥效組合及配伍劑量，亦對(duì)減味壽胎丸進(jìn)行了拆方研究，初步確定減味壽胎丸的黃酮類物質(zhì)藥效較為顯著[4-10]。為了使減味壽胎丸的黃酮進(jìn)一步合理開發(fā)和利用，本研究采用單因素結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選出減味壽胎丸中總黃酮的最佳提取工藝,為減味壽胎丸藥效物質(zhì)的提取提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀系統(tǒng)(BUCHI)；實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)(德國(guó)sartorius公司)；恒溫水浴鍋(上海一恒)；萬分之一電子天平(德國(guó)sartorius公司)；十分之一電子天平(雙杰牌)；紫外分光光度計(jì)(尤尼科(上海)儀器有限公司)。

1.2 試藥 蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)：10080-200707)；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉為分析純?cè)噭?天津大茂化學(xué)廠有限公司)；水為純水；菟絲子(批號(hào)：121002111，產(chǎn)地：山東)和續(xù)斷(批號(hào)：110108341，產(chǎn)地：山東)均購自康美公司，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)黃海波教授鑒定。桑寄生采摘自華南植物園，由華南植物園葉華古研究員鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品約10mg，精密稱定至10mL容量瓶，用60%乙醇超聲溶解，放冷定容，得蘆丁對(duì)照品溶液濃度為0.112mg/mL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，放入10毫升容量瓶?jī)?nèi)，分別加入5.0，4.0，3.0，2.0，1.0，0mL的60%乙醇溶液；加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL搖勻，放置6min；加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，放置6min后；加入4%氫氧化鈉溶液4.0mL，加60%乙醇定容，搖勻后，放置15min；在510nm處測(cè)定吸光度。用0mL作為空白，用濃度(X)作為橫坐標(biāo)，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為：Y=1.205X，r=0.9998，線性范圍為0.112～0.56mg/mL。

2.2 單因素考察

2.2.1 乙醇濃度的考察 準(zhǔn)確稱取菟絲子4g，桑寄生3g，續(xù)斷3g,粉碎過2號(hào)篩，分別加入10倍量的30%，50%，60%，70%，80%，95%乙醇，回流提取1次，提取時(shí)間1.0h，濾過，用少量相應(yīng)溶劑洗滌藥渣和容器，濾液與洗滌液定容至250mL容量瓶中，精密移取1mL至10mL的容量瓶中，用相應(yīng)的溶劑稀釋至刻度，精密移取1mL樣品稀釋液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作項(xiàng)下“加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL搖勻”起，同法操作，顯色后于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮浸出量。結(jié)果顯示，乙醇濃度在30%～60%內(nèi)，隨著醇濃度升高，總黃酮浸出量逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度超過60%后，隨濃度增加而遞減?？梢?，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，總黃酮浸出量達(dá)到最大值。

表1 乙醇濃度考察

2.2.2 提取時(shí)間的考察 準(zhǔn)確稱取菟絲子4g，桑寄生3g，續(xù)斷3g,粉碎過2號(hào)篩，加入10倍量的60%乙醇，回流提取1次，提取時(shí)間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，濾過，用少量60%乙醇洗滌藥渣和容器，濾液與洗滌液定容至250mL量瓶中，其余步驟同“2.2.1”。結(jié)果見表2，結(jié)果顯示當(dāng)提取時(shí)間為1h時(shí)，總黃酮浸出量達(dá)到最大值。

表2 提取時(shí)間考察

2.2.3 料液比及提取次數(shù)的考察 準(zhǔn)確稱取菟絲子4g，桑寄生3g，續(xù)斷3g,粉碎過2號(hào)篩，分別加入6，8，10，12，14，16倍的60%乙醇，每份分別回流提取3次，每次1h，每次所得提取液分別濾過，定容，其余步驟同“2.2.1”。分別計(jì)算每次提取液總黃酮浸出量。

從表3可以看出，當(dāng)料液比為1∶8時(shí)，累積總黃酮浸出量達(dá)到最大值。從表3中也可以計(jì)算出，第1、2次總黃酮浸出量已達(dá)累積總黃酮浸出量的95%以上，說明經(jīng)過2次回流提取后，黃酮類物質(zhì)已經(jīng)提取充分，因此提取次數(shù)定為2次。

表3 料液比和提取次數(shù)的考察

2.3 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素考察結(jié)果及工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)際，選擇乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間為考察因素，分別設(shè)定3個(gè)水平，根據(jù)因素水平表(見表4)，選擇正交表(見表5)進(jìn)行試驗(yàn)，以減味壽胎丸總黃酮浸出量為指標(biāo)，可見分光光度法測(cè)定含量，利用minitab軟件對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1、表7。

根據(jù)圖1主效應(yīng)圖和表6 minitab統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示乙醇濃度及料液比對(duì)產(chǎn)出的影響先是正效應(yīng)，后是負(fù)效應(yīng)，當(dāng)乙醇濃度在50%～60%間，隨乙醇濃度增加而總黃酮浸出量增加，同理料液比亦然，系數(shù)列中絕對(duì)值：47.78>39.17>3.61，則(50%～60%，1∶08～1∶10區(qū)間)影響大?。篈>B>C。在60%～70%間，隨乙醇濃度增加而遞減，同理料液比例亦然，系數(shù)列中絕對(duì)值：39.17>28.06>5.56，則(60%～70%,1∶10～1∶12區(qū)間)影響大?。築>A>C。表7方差分析結(jié)果顯示，A(乙醇濃度)和B(提取時(shí)間)對(duì)減味壽胎丸總黃酮提取的影響有顯著意義，是影響減味壽胎丸總黃酮回流提取工藝的主要因素，在工藝中應(yīng)重點(diǎn)考慮，綜合以上分析，減味壽胎丸最佳提取工藝：乙醇濃度為60%，料液比為1∶10，回流提取2次，每次提取時(shí)間為0.5h。

表4 因素水平表

表5 正交設(shè)計(jì)表

圖1 主效應(yīng)圖

表6 minitab統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表7 方差分析

2.4 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 為進(jìn)一步考察工藝的穩(wěn)定性，按最佳提取工藝，平行重復(fù)3次試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取菟絲子4g，桑寄生3g，續(xù)斷3g,粉碎過2號(hào)篩，加10倍體積60%乙醇，回流提取2次，每次0.5h，過濾定容至250mL，其余步驟同“2.2.1”。結(jié)果見表8，試驗(yàn)結(jié)果可以看出提取工藝具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，適合減味壽胎丸總黃酮的提取。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

減味壽胎丸的主要藥效成分是黃酮類成分，成分較為復(fù)雜，黃酮苷一般能溶于水、稀乙醇、甲醇和乙酸乙酯等極性溶劑中。而黃酮苷元一般溶于乙醇、甲醇和乙酸乙酯、乙醚等溶劑中,不溶于水。故本試驗(yàn)選擇乙醇水溶液作為提取溶劑。單因素考察和正交試驗(yàn)結(jié)果可見，在低濃度和高濃度乙醇提取時(shí)，總黃酮浸出量都較低，可能與減味壽胎丸黃酮類物質(zhì)包含黃酮苷和黃酮苷元有關(guān)。

通過單因素考察及正交試驗(yàn)優(yōu)化了減味壽胎丸總黃酮的提取工藝。最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度為60%，料液比為1∶10，回流提取2次，每次提取時(shí)間為0.5h。經(jīng)驗(yàn)證重復(fù)性好，工藝簡(jiǎn)單，省時(shí)節(jié)能，為進(jìn)一步研究減味壽胎丸提供參考。

[1]高輝，王慶桂.壽胎丸加味治療先兆流產(chǎn)50例[J].中國(guó)中醫(yī)藥雜志，2005,6(5):443-444.

[2]孫杰.加味壽胎丸治療先兆流產(chǎn)52例[J].國(guó)醫(yī)論壇，2008,23(6):32.

[3]姜晶，夏陽.加味壽胎丸治療先兆流產(chǎn)75例[J].廣西中醫(yī)藥2009,32(5):39-40.

[4]郜潔.壽胎丸的藥物組成及其補(bǔ)腎安胎的藥效學(xué)研究[D].廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2009.

[5]郜潔,羅頌平.腎虛黃體抑制大鼠流產(chǎn)模型補(bǔ)腎安胎藥效的初步評(píng)價(jià)[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，,2011，30(13)：145-146.

[6]郜潔,羅頌平.壽胎丸不同提取部位對(duì)腎虛流產(chǎn)模型孕鼠補(bǔ)腎安胎的藥效學(xué)篩選[J].中藥材，2011，34(8)：1 251-1 255.

[7]郜潔,羅頌平.壽胎丸對(duì)腎虛-黃體抑制流產(chǎn)模型大鼠雌激素水平的影響[J].北方藥學(xué)，2011，26(4)：287-289.