宋興超，徐 超，王 雷，巴恒星，王桂武，楊福合

(中國農業(yè)科學院特產研究所 吉林省特種經濟動物分子生物學重點實驗室,吉林 長春 130112)

鹿科與?？苿游颕GF-1基因序列比較及分子進化分析

宋興超，徐 超，王 雷，巴恒星，王桂武，楊福合*

(中國農業(yè)科學院特產研究所 吉林省特種經濟動物分子生物學重點實驗室,吉林 長春 130112)

以GenBank中已登錄的梅花鹿(Cervusnippon)、馬鹿(Cervuselaphus)、普通牛(Bostaurus)、水牛(Bubalusbubalis)、山羊(Caprahircus)和綿羊(Ovisaries)胰島素樣生長因子-1(IGF-1)基因mRNA序列為研究材料，通過DNAStar 7.0等生物信息學軟件對6個物種的IGF-1基因進行序列比較及分子進化分析。結果表明：鹿科與?？苿游颕GF-1基因編碼區(qū)均為465 bp，并且堿基組成表現(xiàn)為G>C>A>T，且G+C含量高于A+T；6個物種IGF-1基因密碼子第1位富含A，密碼子第2位4種堿基的分布相對均勻，密碼子的第3位堿基C含量較高；編碼區(qū)堿基序列中共檢測到20個變異位點，包括10個單一變異和10個簡約變異，鹿科和?？苿游颕GF-1基因核苷酸和氨基酸序列的相似性均較高；(4) NJ和UPGMA兩種方法構建的分子進化樹均把6個物種聚為2個大類：鹿科和?？疲渲信？朴址种С雠喛坪脱騺喛苾深?。

鹿科；?？?；胰島素樣生長因子-1基因；序列比較；密碼子

胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factors，IGFs)是一類廣泛存在于動物體組織內且能夠促進細胞分化、蛋白質沉積、骨骼增長以及個體生長發(fā)育的多功能細胞增殖調控因子[1]。IGFs系統(tǒng)包括I型胰島素樣生長因子(IGF-1)、II型胰島素樣生長因子(IGF-2)、胰島素樣生長因子受體(IGF-1 R和IGF-2 R)、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)、IGFBP相關蛋白及IGFBP酶等[2]。其中，IGF-1基因被認為是影響動物生長性狀的重要候選基因，隨著分子生物學技術在畜禽育種研究中的逐漸應用，IGF-1基因也作為一種有效的遺傳標記在豬[3]、牛[4]、羊[5]和雞[6]等畜禽上進行了較為深入的研究，特別是近年來，有關鹿科動物IGF-1基因分離、鑒定及其與鹿茸生長關系的研究資料相對豐富。杜智恒等[7]首次在國內對梅花鹿IGF-1基因進行了克隆，獲得DNA核苷酸序列長度為764 bp且與豬、牛和羊該基因同源性均為90%以上。胡薇等[8]通過RT-PCR方法分離得到梅花鹿IGF-1基因465 bp mRNA序列，相對熒光定量PCR差異分析發(fā)現(xiàn)該基因在鹿茸頂端的前軟骨和軟骨組織的表達水平高于真皮和間充質組織。郝林琳等[9]采用生物信息學方法預測馬鹿該基因5′調控區(qū)含有CpG島和253個潛在的轉錄因子結合位點并且與牛、羊存在差異。李兆志等[10]利用PCR-SSCP技術檢測到左家地區(qū)梅花鹿群體IGF-1基因啟動子區(qū)包括多個突變位點。到目前為止，IGF-1基因被認為是刺激鹿茸細胞分裂增殖最強的生長因子，并且NCBI的GenBank數(shù)據庫中已經能夠檢索到多個鹿科動物IGF-1基因序列，同時，?？婆c鹿科動物同屬偶蹄目反芻動物，而生長發(fā)育對于這兩種動物都是非常重要的經濟性狀。因此，本研究利用生物信息學方法對鹿科和牛科動物IGF-1基因mRNA序列進行比較，進一步構建6個物種的分子進化樹，旨在探討鹿科和?？苿游镌摶蛐蛄凶儺愄攸c及物種進化關系，為進一步尋找IGF-1基因功能分化位點提供生物學基礎資料。

1 材料與方法

1.1 序列來源

從GenBank的核苷酸序列數(shù)據庫中下載梅花鹿、馬鹿、普通牛、水牛、山羊和綿羊的胰島素樣生長因子-1(IGF-1)基因全長cDNA序列，各物種序列信息見表1。

1.2 分析方法

鹿科和?？苿游颕GF-1基因核苷酸序列堿基組成由BioEdit 7.0和DNAStar 7.0軟件完成；采用DNAStar 7.0軟件中MegAlign程序對6個物種IGF-1基因編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列進行差異分析及相似性比較；利用Clustal X 1.83對IGF-1基因氨基酸序列進行完全比對，進一步基于MEGA 5.05軟件的NJ(neighbor-joining，鄰近法)和UPGMA(unweighed pair group method with arithmetic mean,非對組算數(shù)平均法)2種方法分別進行鹿科與?？苿游颕GF-1基因分子進化分析。

表1 從NCBI中獲取的鹿科和?？苿游?IGF-1基因核苷酸和氨基酸序列Table 1 Nucleotide and amino acid sequences of IGF-1 gene of Cervidae and Bovidae species

2 結果與分析

2.1 cDNA序列堿基組成

由表2可知，鹿科與?？苿游镌摶蚓幋a序列堿基組成基本一致，均為G>C>A>T，且G+C含量高于A+T，梅花鹿和馬鹿的T堿基百分含量最低。從4種堿基在密碼子的分布情況可知，鹿科和?？苿游锩艽a子中堿基分布存在相似的規(guī)律，密碼子第1位富含A，密碼子第2位4種堿基的分布相對均勻，密碼子的第3位C堿基含量較高，A堿基含量最低，其中梅花鹿C堿基含量達39.4%，而水牛的A堿基含量最低，為11.0%。

表2 鹿科和牛科動物IGF-1基因cDNA序列堿基組成Table 2 Base composition of IGF-1 gene of Cervidae and Bovidae species

注：表中數(shù)字1，2，3分別代表密碼子的第1、2、3位。

Note：No.1,2 and 3 represent the 1st,2ndand 3rdcodon position,respectively.

2.2 核苷酸與氨基酸序列變異

GenBank數(shù)據庫中公布的鹿科和牛科動物IGF-1基因mRNA序列長度不一致，其中鹿科中的梅花鹿和馬鹿分別為465 bp和809 bp，?？苿游镏衅胀ㄅ?、水牛、山羊和綿羊分別為874 bp、538 bp、978 bp和595 bp，但鹿科與?？苿游镌摶蛲暾幋a區(qū)序列均為465 bp，這6個物種編碼序列堿基變異情況如圖1所示，以梅花鹿IGF-1基因序列作為標準，共檢測到20個變異位點，其中，10個單一變異位點(Singleton variable sites)為：g.84A>G，g.111C>T，g.131C>G，g.201C>T，g.240C>T，g.258G>A，g.343C>G，g.354G>A，g.435C>G，g.439G>T，10個簡約變異位點(Parsimony informative sites)為：g.78C>A，g.79G>A，g.105C>T，g.153 C>T，g.270 G>A，g.276A>C，g.330C>T，g.346A>G，g.352G>T，g.429C>T。在梅花鹿與馬鹿及普通牛與水牛IGF-1基因序列中，僅存在3個變異位點，而山羊與綿羊間卻產生了8個堿基變異。另外，在變異的堿基中，發(fā)生在第3密碼子位置上有14處，占70%，密碼子第1位存在5處堿基變異，只有1處變異發(fā)生在密碼子第2位，表現(xiàn)出密碼子的第2位非常保守，密碼子堿基第3位的變異率明顯高第1、2位，符合密碼子擺動性的特點。序列相似性比對表明梅花鹿與馬鹿、普通牛、水牛、山羊和綿羊IGF-1基因編碼區(qū)核苷酸序列相似性分別為99.4%、98.1%、97.6%、97.6%和97.6%。

圖1 鹿科與牛科動物IGF-1基因編碼區(qū)堿基變異位點(·表示相同核苷酸)Fig.1 Nucleotide variable sites of IGF-1 gene between Cervidae and Bovidae species(·Indicates the identity of nucleotides)

從氨基酸序列比對結果來看(圖2)，鹿科與牛科動物IGF-1基因均編碼154個氨基酸，鹿科動物中梅花鹿與馬鹿IGF-1基因編碼氨基酸序列相似性為99.4%，?？苿游镏衅胀ㄅＥc水牛、山羊和綿羊的相似性分別為100%、98.7%和98.1%，普通牛和水牛的氨基酸序列完全一致。

圖2 鹿科與牛科動物IGF-1基因編碼區(qū)氨基酸變異位點(·表示相同氨基酸)Fig.2 Amino acid variable sites of IGF-1 gene in Cervidae and Bovidae species (·indicates the identity of amino acid)

2.3 分子進化樹構建

鹿科和?？苿游锏腎GF-1基因編碼區(qū)核苷酸序列通過MEGA 5.0軟件的NJ法和UPGMA法分別構建6個物種分子進化樹(圖3和4)，Bootstrap值是基于1000次模擬產生的，各個分支的置信度較高，結果表明，兩種方法構建的進化樹均把6個物種聚為2個大類：鹿科和?？?，其中牛科又分支出牛亞科和羊亞科兩類，這種聚類與NCBI中動物系統(tǒng)分類結果基本相符。

3 討 論

3.1 鹿科與?？苿游颕GF-1基因序列差異

本研究通過生物信息學方法分析了鹿科與?？苿游颕GF-1基因的堿基組成特點，同時參考了前人的研究結果，最終發(fā)現(xiàn)，該研究中所涉及到的6種動物的A、T、C、G的含量與胡薇等[8]研究結果基本一致，均為G+C含量明顯高于A+T。王寧等[11]研究表明，G+C含量與核苷酸替代速率之間呈反比，由于IGF-1基因在哺乳動物進化過程中起主要調控作用，該基因的表達量決定了物種的生長速度，其編碼區(qū)核苷酸替代速率必然低于非功能基因，因此導致該基因G+C含量較高。根據本研究結果，鹿科和?？苿游颕GF-1基因核苷酸序列中共檢測到20個變異位點，其中梅花鹿與馬鹿間變異位點較少，相似性達到99.4%，胡薇等[8]對梅花鹿IGF-1基因克隆測序表明，梅花鹿與馬鹿IGF-1基因核苷酸序列同源性達到99.78%，與本研究結果相似；而山羊和綿羊之間存在8個變異位點，這些變異位點與IGF-1基因的表達產物以及與鹿科和?？莆锓N表型差異的關系將是我們今后的工作目標。此外，從IGF-1基因編碼區(qū)密碼子堿基的分布情況可以看出，鹿科和?？苿游镌摶虼嬖谙嗤淖兓?guī)律并且密碼子第3位的變異率明顯高于第1和第2位，符合搖擺假說(wobble hypothesis)，即密碼子第3位堿基允許有一定程度的擺動[12]。這與李鵬飛等[13]分析魚類線粒體DNA Cyt b基因序列密碼子組成特點的研究結果一致。

圖3 NJ法構建的分子系統(tǒng)進化樹Fig.3 Molecular phylogenetic tree by NJ method

圖4 UPGMA法構建的分子系統(tǒng)進化樹Fig.4 Molecular phylogenetic tree by UPGMA method

3.2 鹿科與?？苿游锏姆肿舆M化分析

從動物分類學角度分析，本研究中梅花鹿和馬鹿屬于鹿科物種[14]，普通牛、水牛、山羊和綿羊同屬?？莆锓N，其中普通牛和水牛屬?？浦械呐喛?，而山羊和綿羊則屬于?？浦械难騺喛芠15]。眾多研究者以不同基因為研究對象，采用不同方法對鹿科與?？苿游锏倪z傳分化進行了分析。Wada等[16]分別通過NJ和MP方法，構建了包括鹿科和牛科在內的12個物種線粒體基因組核苷酸及其編碼氨基酸序列系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)鹿科、牛亞科及羊亞科在不同的進化枝上。Klungland等[17]利用核基因黑素皮質激素受體-1(MC1R)基因分析了鹿科與?？苿游锏倪z傳分進化關系，表明鹿科和?？苿游锏腗C1R基因核苷酸歧異度為5.3%～6.8%，構建的有根進化樹與當前動物分類學一致。侯佩興等[18]研究表明，偶蹄目動物的性別決定(Sex-determining Region of Y-chromosome，SRY)基因按照其所處的科聚成了2類，即鹿科和?？啤１狙芯恳訥enBank中公布的2種鹿科動物和4種?？苿游颕GF-1基因編碼氨基酸序列為研究對象，分別通過NJ和UPGMA兩種方法構建系統(tǒng)進化樹，分析鹿科和?？苿游锏姆肿舆M化關系，表明梅花鹿與馬鹿間的遺傳距離最短且普通牛、水牛與山羊、綿羊分屬兩個不同的亞科。本研究結果與前人研究基本一致，進一步解釋了物種間的分化程度與堿基序列差異之間存在相關性，同時也證明了通過核內基因來分析鹿科和牛科動物系統(tǒng)進化的可行性。

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SequenceComparisonandMolecularEvolutionAnalysisofIGF-1GeneofCervidaeandBovidaeSpecies

SONG Xing-chao,XU Chao,WANG Lei,Ba Heng-xing,WANG Gui-wu,YANG Fu-he*

(StateKeyLaboratoryofSpecialEconomicAnimalMolecularBiology,InstituteofSpecialAnimalandPlantScienceofCAAS,Changchun,Jilin130112,China)

Based on the IGF-1 gene nucleotide and amino acid sequences ofCervusnppon,Cervuselaphus,Bostaurus,Bubalusbubalis,Caprahircusand Ovis aries registered in GenBank,sequence variation and molecular evolution of IGF-1 gene were analyzed by means of bioinformatics software.The results showed that the lengths of IGF-1 gene coding sequences of Cervidae and Bovidae species were both 465 bp with the base composition being G>C>A>T and the content of G+C higher than that of A+T.Tthe first position of IGF-1 gene codon of the 6 species were rich in A,and the four bases in the second position were relatively even in distribution.A higher content of C in the third position.A total of 20 polymorphic sites including 10 singleton sites and 10 parsimony informative sites were detected among the 6 species,and a greater similarity of nucleotide and amino acid sequence in Cervidae and Bovidae species was observed.According to the molecular evolutionary tree constructed by NJ and UPGMA method,the 6 species fell into two broad categories: Cervidae and Bovidae with Bovidae including Bovidae and Capinae.

cervidae；bovidae；IGF-1 gene；sequence comparison；codon

2013-09-26，

2013-12-09

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(2012CB722907);國家科技支撐計劃項目(2011BAI03B02)

宋興超(1982-)，男，河北保定人，在讀博士，助理研究員，研究方向：特種經濟動物遺傳育種。E-mail：tcssxc@126.com

*[通訊作者]楊福合(1956-)，男，河北人，研究員，博士生導師，研究方向：特種經濟動物種質資源收集、評價及遺傳育種。E-mail：yangfh@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)03-0014-05