彭蘭慧，何革生，黃蓋群；高 輝

1.南充市嘉陵區(qū)環(huán)境監(jiān)測站，四川南充，637005;2.南充市嘉陵區(qū)環(huán)境保護局，四川南充，637005;3.四川省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所，四川南充，637000；4.西華師范大學生命科學學院，四川南充，637002

南充市污水微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及特性的研究

彭蘭慧1，何革生2，黃蓋群3；高 輝4

1.南充市嘉陵區(qū)環(huán)境監(jiān)測站，四川南充，637005;2.南充市嘉陵區(qū)環(huán)境保護局，四川南充，637005;3.四川省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所，四川南充，637000；4.西華師范大學生命科學學院，四川南充，637002

從南充市嘉東污水處理廠活性污泥中分離出一株絮凝活性較高、絮凝劑產(chǎn)量較好的菌株(A3)，通過生理生化分析及16S rDNA序列鑒定該菌株為根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)。對A3生長特性進行了研究，結果表明：A3菌株的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為尿素。在室溫下，pH值為10.0時,A3菌株絮凝力最高為94.70%；最適的金屬離子、發(fā)酵液添量、發(fā)酵溫度分別為Ca2+、2 mL、30℃。

微生物絮凝劑；生長特性；絮凝特性

當前，隨著人類社會的發(fā)展，水污染越來越嚴重。為保證水資源的可持續(xù)利用，必須解決水污染問題，人類在水處理方面做了大量工作，開發(fā)出多種水處理方法，如絮凝沉淀法、生化法、離子交換法、吸附法、化學氧化法、電滲析法和生態(tài)處理法等。在絮凝沉淀法中，絮凝劑起著非常重要的作用[1]。絮凝劑可分為有機高分子絮凝劑、無機絮凝劑、微生物絮凝劑。其中，微生物合成的具有絮凝能力的生物大分子，不僅具有傳統(tǒng)絮凝劑的優(yōu)點，更具有傳統(tǒng)絮凝劑所沒有的優(yōu)點，因此有關微生物絮凝劑方面的研究越來越受國內(nèi)外的關注[2]。隨著人們對微生物絮凝劑研究的不斷深入，微生物絮凝劑在水處理方面的應用范圍也越來越廣。微生物絮凝劑不僅具有高效、無毒、無污染和使用條件粗放等特點，而且產(chǎn)生菌來源廣泛，種類多，是極具有開發(fā)價值的水處理劑。本研究從污水活性土壤中分離得到一株絮凝活性較高、絮凝劑產(chǎn)量較好的菌株，并對其絮凝劑的產(chǎn)生條件和絮凝條件以及菌株在不同培養(yǎng)條件和絮凝條件下對高嶺土懸浮液的絮凝效果進行研究，為進一步研究微生物絮凝劑的絮凝機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料1.1.1 菌種來源

實驗菌種來源于南充市嘉東污水處理廠的活性污泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)富集及篩選培養(yǎng)基 細菌培養(yǎng)基(LB)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0，121℃滅菌20 min。細菌培養(yǎng)基(LA)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl10 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0，121℃滅菌20min。

(2)發(fā)酵用培養(yǎng)基 葡萄糖20 g，KH2PO42 g，K2HPO45 g，NaCl 0.1 g，(NH4)2CO31.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH 8.0，115℃滅菌30 min。

(3)碳源測試培養(yǎng)基 碳源20.0g/L，K2HPO45.0 g/L，KH2PO42.0g/L，NaCl 0.1 g/L，(NH4)2SO40.2 g/L，脲 0.5 g/L，酵母粉0.5 g/L，MgSO40.2 g/L，pH 8.0，115℃滅菌30 min。

供測試的碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘油、乙醇、淀粉。

(4)氮源測試培養(yǎng)基 葡萄糖20.0 g/L，K2HPO45.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，NaCl 0.1 g/L，氮源1.5 g/L，MgSO40.2 g/L，pH 8.0，115℃滅菌30 min。

供測試的氮源有蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、谷氨酸、硝酸鉀、碳酸銨、硫酸銨、硝酸銨。

1.1.3 主要實驗儀器與設備

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、高速離心機、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴搖床、分光光度計、冰箱、分析天平。

1.2 菌株的篩選與分離鑒定

1.2.1 菌種的富集

取活性污泥約10.0 g，加入無菌水100 mL，搖勻后靜置15 min，取上清液1 mL加入到富集培養(yǎng)基，30℃、150 r/min培養(yǎng)48 h后,取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新的富集培養(yǎng)基中,相同條件下培養(yǎng)48 h，再重復一次。

1.2.2 菌種的分離

用無菌吸管吸取富集培養(yǎng)液1 mL，移入盛有9 mL無菌水的試管中，制成10-1稀釋液，再用無菌吸管吸取10-1稀釋液1 mL，移入另一盛有9 mL無菌水的試管中，制成10-2稀釋液，以此類推,分別制成10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液。然后，用無菌吸管吸取0.1 mL10-4、10-5、10-6稀釋度的菌液，接種到LA分離培養(yǎng)基上，用無菌玻璃涂布棒進行涂布，每個稀釋度做5個平行樣，最后放到30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，觀察LA培養(yǎng)基上微生物的生長情況。最后，選取生長良好、表面光滑且?guī)д承缘募毦鷨尉?，轉(zhuǎn)接到LA斜面培養(yǎng)基上于培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24 h后，放于4℃冰箱中保存，用于進一步篩選。

1.2.3 初篩

將分離獲得的菌株分別接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于搖床中于30℃、150r/min培養(yǎng)72 h，分別取相同量發(fā)酵液加入高嶺土懸浮液，目測各菌株發(fā)酵液對高嶺土懸液絮凝效果情況，記錄下絮凝沉淀顆粒大小和上清液比較清澈的菌株。

1.2.4 復篩

將初篩獲得的菌株接種到裝有50 mL滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在30℃、150r/min條件下培養(yǎng)72 h，將所得發(fā)酵液進行絮凝活性測定。

1.2.5 菌株的鑒定

對篩選出絮凝活性最高的菌株，根據(jù)菌落特征，進行初步鑒定；然后，再進行分子生物學鑒定，按照傳統(tǒng)提取細菌基因組DNA[3]方法，選擇16S rDNA基因通用引物序列分別為：(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。PCR反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)。將PCR擴增產(chǎn)物用試劑盒純化，送上海捷瑞生物工程有限公司測序。

1.2.6 絮凝率的測定方法

參照文獻[4]的方法進行。

1.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

分別改變發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源的種類，取48 h發(fā)酵液2 mL處理含有0.2 g高嶺土100 mL懸濁液，對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化[5]。

1.4 細菌絮凝劑絮凝效果

選擇pH值、不同金屬離子、發(fā)酵液添加量、溫度4個主要影響因素，對1.1.3中的高嶺土懸濁液進行絮凝處理[6]。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選

經(jīng)3次連續(xù)富集培養(yǎng)，得到了樣品的混濁培養(yǎng)液，表明樣品中的微生物在富集培養(yǎng)基上可以大量繁殖。利用稀釋平板法對富集培養(yǎng)液中的微生物進行分離，結果得到8株優(yōu)勢菌株。根據(jù)培養(yǎng)基上生長的菌株的菌落形態(tài)、顏色、大小等特征，對它們進行初步分類。將這8株菌作為初步篩選的對象，并分別編號為A1、A2、A3、A4、B1、B2、C1、C2。經(jīng)初篩，A1、A2、A4、B1、B2、C1、C2產(chǎn)生絮凝塊小，速度慢；A3絮凝時絮凝塊較大且沉降速度快，絮凝效果比較好。從初篩得到的8株菌株中獲得1株絮凝活性較好的絮凝劑產(chǎn)生菌A3，絮凝率是94.70%(表1)。將A3接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中于30℃、150 r/min培養(yǎng)72 h。A3接種8 h，發(fā)酵液開始變渾濁，12 h后濁度明顯增加，28 h后發(fā)酵液開始有少量氣泡，隨著培養(yǎng)時間的增加，氣泡量也增加。

表1 產(chǎn)生絮凝劑菌株的篩選結果

2.2 菌株的觀察與鑒定

對篩選出的優(yōu)勢菌株A3進行分離、鑒定，菌株呈桿狀，革蘭氏陰性菌，有橢圓形芽孢。菌落形態(tài)規(guī)則，表面濕潤、凸起，菌體為乳白色且不透明。獲得的菌株A3 16S rDNA擴增片段為1 467 bp，測序結果表明，該序列與根瘤土壤桿菌16S rDNA序列有較高的同源性(99.78%)，結合形態(tài)學和生理生化特征鑒定其為根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)。

2.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 碳源對絮凝活性的影響

選取葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、乙醇、甘油作為A3菌株的碳源，測定其生長量，結果表明(圖1)，A3菌株對碳源的利用存在差異，其中以淀粉作為碳源細菌的生長量最高，達0.144 g，但長勢不好。以蔗糖、麥芽糖作為碳源，細菌生長量分別為0.135 g、0.118 g，且比較好，說明蔗糖、麥芽糖最適合作為A3菌株的碳源。從圖1還可看出，乙醇、甘油作為碳源添加，細菌生長量僅為0.078 g、0.095 g，且細菌長勢不好，故不宜作為A3的碳源。

圖1 不同碳源對絮凝活性的影響

圖2 不同碳源對絮凝活性的影響

2.3.2 氮源對絮凝活性的影響

選取蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、谷氨酸、甘氨酸、硝酸鉀、碳酸銨、硫酸銨、硝酸銨作為A3菌株的氮源，測定其生長量，結果表明(圖2)，A3對氮源的利用存在差異，尿素、硫酸銨、碳酸銨作為氮源添加對菌株生長有利，菌體生長量分別為0.112 g、0.109 g、0.091 g,其中對尿素的利用最好,較適宜作為氮源添加。甘氨酸作為氮源添加效果最差，菌體生長重量僅為0.015 g,而且菌株生長情況較差，不適宜作為A3菌株的氮源。

2.4 絮凝條件優(yōu)化

2.4.1 pH對A3發(fā)酵液絮凝率的影響

在其他條件不變的情況下，培養(yǎng)基pH值分別調(diào)為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，實驗結果表明(圖3)，在pH值為8.0～12.0范圍內(nèi)菌體絮凝率較高，pH值為10.0時絮凝率最高，達到91.42%；pH在10.0以上，隨著pH值的升高絮凝率反而下降，表明強堿性抑制微生物絮凝活性物質(zhì)的分泌；在pH值為10.0時達到最大，表明適當?shù)膲A性條件下有利于微生物的生長。由圖4可見，在pH值為6.0～7.0的酸性條件下，絮凝作用較弱，而且隨著酸性的減弱，尤其當pH值超過7.0時，絮凝活性迅速升高，并基本維持在71%以上。因此，該微生物絮凝劑適宜的pH值范圍為8.0～12.0，其中pH值為10.0時最佳。

圖3 pH值對絮凝活性的影響

2.4.2 金屬離子對A3發(fā)酵液絮凝率的影響

在培養(yǎng)基中分別加入2mL 0.5g/L的Mg2+、Ca2+、Na2+、Fe2+、K2+、Al3+、Cu2+等不同的金屬離子，實驗結果顯示(圖4)，未加任何金屬離子的空白實驗的絮凝效果最差，絮凝率僅為25.30%；但添加不同的金屬離子對絮凝活性有不同的作用，其中Al3+、Cu2+對懸濁液的絮凝作用不大，絮凝率僅為43.4%、37.1%；其他的金屬離子均有明顯的助凝效果，其中以Ca2+的助凝效果最好，絮凝率達93.6%。

圖4 不同金屬離子對絮凝活性的影響

圖5 不同發(fā)酵液添加量對絮凝活性的影響

2.4.3 發(fā)酵液添加量對A3發(fā)酵液絮凝率的影響

設5個發(fā)酵液添加量梯度：1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，實驗結果表明(圖5)，在低濃度范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵液添加量的增加，絮凝率隨之提高；在2 mL添加量時，絮凝率達到最高值84.9%；但隨著濃度的再增加，所形成的絮凝體會重新變成穩(wěn)定膠體，絮凝率反而不斷下降，因此確定最佳的發(fā)酵液添加量為2 mL。

2.4.4 不同溫度對A3發(fā)酵液絮凝率的影響

實驗共設5個溫度梯度：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，結果表明(圖6)，菌株A3在20℃～30℃時,絮凝劑絮凝率隨著溫度的升高而增加，在30℃時絮凝率達到最大值87.7%；但在30℃～40℃時，絮凝劑絮凝率隨著溫度的升高而逐漸降低，在40℃時絮凝率降到55.4%。由此得出最佳培養(yǎng)溫度為30℃，該溫度和細菌的最佳生長溫度一致。

圖6 不同溫度對絮凝活性的影響

3 結論與討論

本實驗從南充市嘉東污水處理廠的活性污泥中獲得了8株具有絮凝效果的菌株，且快速分離了1株產(chǎn)絮凝劑的微生物,菌株標號為A3，絮凝率為94.70%。通過對獲得的菌株A3 16S rDNA擴增片段為1 467 bp，測序結果表明該序列與根瘤土壤桿菌16S rDNA序列有較高的同源性，為99.78%，結合生理生化分析及16S rDNA序列鑒定該菌株為根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)。采用單因素法研究培養(yǎng)基中碳源、氮源對其絮凝活性的影響，并對A3菌株進行優(yōu)化培養(yǎng)。初步確定A3菌株生長的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為尿素；培養(yǎng)基應調(diào)成堿性，pH值為10.0時A3菌株絮凝率為94.70%。最終確定pH值最適范圍為8.0～12.0，其中pH值為10.0時絮凝效果最佳；培養(yǎng)基添加金屬離子均有明顯的助凝效果，其中以Ca2+的助凝效果最好，絮凝率可達93.6%；最佳的發(fā)酵液添加量為2 mL；最佳培養(yǎng)溫度為30℃。本研究獲得的高效微生物絮凝劑能否適合其他不同條件的污水環(huán)境，還需要作進一步的實驗研究。在今后的研究中將對篩選出的優(yōu)勢菌株進行遺傳改造，大幅度提高微生物的降解能力，以適應不同的廢水處理要求，從而降低污水處理成本，提高處理效率。

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(責任編輯：汪材印)

2014-05-12

彭蘭慧(1983-)，女，四川隆昌人，助理工程師，主要研究方向：環(huán)境工程及環(huán)境監(jiān)測。

10.3969/j.issn.1673-2006.2014.09.028

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1673-2006(2014)09-0090-04