王 瑋，滑 天，曹金鳳，郝桂敏，崔 娜，姜 蕾(.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科，河北 石家莊 050000；.河北省邢臺市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 邢臺05403)

·論著·

多囊卵巢綜合征患者子宮內(nèi)膜胰島素受體底物的表達

王 瑋1，滑 天2，曹金鳳1，郝桂敏1，崔 娜1，姜 蕾1
(1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科，河北 石家莊 050000；2.河北省邢臺市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 邢臺054031)

目的觀察胰島素受體底物(insulin receptor substrate,IRS)在多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)患者子宮內(nèi)膜的表達及酪氨酸磷酸化的程度，探討其與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)的相關(guān)性。方法PCOS組30例，根據(jù)PCOS診斷標準選擇；對照組30例，選擇同期就診的與PCOS組年齡匹配，平素月經(jīng)周期規(guī)則，經(jīng)檢測血清激素、空腹血糖和胰島素均在正常范圍的婦女。PCOS組分為胰島素抵抗亞組(IR組)17例及非胰島素抵抗亞組(非IR組)13例。采用免疫組織化學方法檢測子宮內(nèi)膜IRS-1和IRS-2蛋白的表達及IRS-1和IRS-2酪氨酸磷酸化的程度。結(jié)果PCOS組子宮內(nèi)膜IRS-1、IRS-2的蛋白表達和酪氨酸磷酸化程度顯著弱于對照組(P<0.05)。PCOS伴IR組子宮內(nèi)膜IRS-1、IRS-2的蛋白表達和酪氨酸磷酸化程度明顯弱于PCOS非IR組(P<0.05)。結(jié)論IRS-1和IRS-2蛋白及酪氨酸磷酸化程度在PCOS患者子宮內(nèi)膜表達下降，伴IR的PCOS患者表達下降更明顯。推測PCOS患者子宮內(nèi)膜IRS的表達異常和酪氨酸磷酸化程度下降與子宮內(nèi)膜IR的發(fā)生有密切關(guān)系。

多囊卵巢綜合征；受體，胰島素；子宮內(nèi)膜

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.07.001

囊卵巢綜合征(polycysticovarysyndrome,PCOS)發(fā)病率占育齡婦女5%～10%，是一種常見的生殖內(nèi)分泌紊亂性疾病。主要特征是長期無排卵、月經(jīng)異常、卵巢多囊樣改變以及高雄激素血癥等一系列表現(xiàn)。研究[1]表明，50%～70%PCOS患者存在胰島素抵抗(insulinresistance,IR)。胰島素受體底物(insulinreceptorsubstrate,IRS)是胰島素受體后信號傳導通路上重要的船塢蛋白，在胰島素信號轉(zhuǎn)導通路中起主要作用的是IRS-1和IRS-2[2]。通過既往對PCOS患者脂肪組織的研究[3]發(fā)現(xiàn)，IRS蛋白表達異常和酪氨酸磷酸化異?？梢餚COS患者IR。目前尚無有關(guān)PCOS患者子宮內(nèi)膜IRS表達的相關(guān)報道。本研究檢測PCOS患者子宮內(nèi)膜IRS蛋白表達及酪氨酸磷酸化程度，旨在探討其與PCOS患者子宮內(nèi)膜IR的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2011年10月—2012年10月在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科就診的PCOS患者30例為PCOS組，均符合2003年鹿特丹修正的PCOS診斷標準[4]，年齡22～38歲，平均(28.46±3.02)歲。對照組選擇同期就診的與PCOS組年齡匹配，年齡24～37歲，平均(27.96±2.87)歲，平素月經(jīng)周期規(guī)則，經(jīng)檢測血清激素、空腹血糖(fastingplasmaglucose，F(xiàn)PG)和空腹胰島素(fastinginsulin，F(xiàn)INS)均在正常范圍的婦女。所有PCOS患者和對照組均排除糖尿病家族史及其他內(nèi)分泌疾病，近3個月內(nèi)無激素類藥物使用。PCOS組又分為IR亞組17例和非IR亞組13例。IR診斷依據(jù)為胰島素抵抗指數(shù)(HomeostasisModelAssessmentforInsulinResistance,HOMA-IR)=FPG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5>2.21[5]。

1.2 研究方法

1.2.1 標本收集:所有研究對象于月經(jīng)周期第1天或孕激素撤退性出血的第1～3天早晨，閉經(jīng)者可在任何時間，禁食12h后，空腹抽取靜脈血，檢測血清激素和空腹血糖、胰島素水平。所有研究對象均知情同意，并簽署知情同意書。于月經(jīng)周期第1天或閉經(jīng)的任意時間，行診斷性刮宮，采集子宮內(nèi)膜組織標本。新鮮的子宮內(nèi)膜組織標本，經(jīng)37 ℃生理鹽水沖洗，由4%甲醛固定，行石蠟包埋。石蠟塊切片厚度為3～4μm，用于免疫組織化學染色和檢測。

1.2.2 項目檢測方法:血清睪酮(testosterone，T)、黃體生成素(luteinizinghormone，LH)、卵泡刺激素(folliclestimulatinghormone，F(xiàn)SH)、FINS及FPG均使用化學發(fā)光法檢測。免疫組織化學實驗方法,取子宮內(nèi)膜組織切片，常規(guī)脫蠟至水。一抗選用兔抗IRS-1抗體(Santacrui公司產(chǎn)品PR-0280)、兔抗IRS-2抗體(Santacrui公司產(chǎn)品PR-0281)、鼠抗P-tyr(IRS-1)抗體(Santacrui公司產(chǎn)品SC-17196)、鼠抗P-tyr(IRS-2)抗體(Santacrui公司產(chǎn)品BS-5397R)，SP法(試劑盒為河北博海生物工程開發(fā)有限公司進口分裝)，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察。IRS-1、IRS-2及P-tyr免疫組織化學的陽性判定為子宮內(nèi)膜腺上皮細胞染色黃色。圖像信息經(jīng)HMIAS-2000高清晰彩色醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分析，以單位灰度值(Grey)表示切片中顯色陽性區(qū)域的強弱，Grey與陽性強度成反比，即染色越強Grey數(shù)值越小。對少數(shù)不易判斷的切片重新共同閱片而定。

2 結(jié) 果

2.1 血清激素結(jié)果比較：IR亞組、非IR亞組LH、T水平和LH/FSH比值較對照組高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IR亞組HOMA-IR顯著高于非IR亞組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 子宮內(nèi)膜各指標免疫組織化學檢測結(jié)果：PCOS組較對照組子宮內(nèi)膜IRS-1、IRS-2表達顯著減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PCOS組子宮內(nèi)膜IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化程度較對照組明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2，圖1～4。

IR亞組子宮內(nèi)膜IRS-1、IRS-2表達顯著弱于非IR亞組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IR亞組子宮內(nèi)膜IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化程度顯著弱于非IR亞組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3，圖1～4。

GroupsnLH(U/L)FSH(U/L)T(μg/L)LH/FSHHOMA?IRPCOSwithIR1714．82±2．70?5．98±0．852．80±0．41?2．63±0．46?3．45±1．43?#PCOSwithoutIR1313．67±1．87?6．01±0．922．43±0．52?2．27±0．54?1．77±0．81Control306．92±2．676．02±0．870．87±0．200．75±0．351．97±0．91

*P<0.05vscontrol group #P<0.05vsPCOS without IR group byANONA
PCOS：polycystic ovary syndrome；LH：luteinizing hormone；FSH：follicle stimulating hormone；T：testosterone；HOMA-IR：homeostasis model assessment for insulin resistance

GroupsIRS?1IRS?2P?IRS?1P?IRS?2PCOS 63．65±10．8785．67±11．92129．51±16．89124．15±14．67Control56．15±6．8674．73±12．99116．23±12．91113．65±12．83t2．7112．5842．2822．527P0．0080．0160．0370．017

PCOS：polycystic ovary syndrome； IRS：insulin receptor substrate；P-IRS：tyrosine phosphorylation of insulin receptor substrate

GroupsnIRS?1IRS?2P?IRS?1P?IRS?2PCOSwithIR1778．25±9．6289．43±11．78139．65±16．34132．54±15．97?PCOSwithoutIR1358．78±7．4381．29±8．72121．19±10．68118．29±12．82 t2．2833．6422．0902．081 P0．0410．0150．0360．043

PCOS：polycystic ovary syndrome；IRS：insulin receptor substrate；P-IRS：tyrosine phosphorylation of insulin receptor substrate

3 討 論

PCOS患者常常伴有IR和代償性高胰島素血癥，二者是這類患者發(fā)生生殖功能障礙及糖代謝異常的病理基礎。當PCOS患者處于IR狀態(tài)時，組織細胞和器官通常需要較正常時更多的胰島素來完成糖代謝，胰島β細胞代償性分泌較多的胰島素，因此形成高胰島素血癥[6]。胰島素調(diào)節(jié)葡萄糖代謝分3個不同階段，即受體前水平、受體水平和受體后水平。PCOS患者IR的發(fā)生機制也圍繞這3個階段。

目前有關(guān)分子靶點及細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導，在受體后水平IR的發(fā)病機制中越來越受到重視。胰島素與其受體結(jié)合，啟動信號向細胞內(nèi)的傳遞過程，這一過程不僅包括信號之間的傳遞和放大，而且包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間交聯(lián)反應、蛋白的磷酸化和脫磷酸化過程[7]。近年文獻[8-9]顯示，胰島素受體(insulin receptor，INSR)、IRS和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)共同參與胰島素刺激組織對葡萄糖的攝取和利用，并通過一系列信號傳導過程參與IR的形成。

IRS是體內(nèi)重要的信號蛋白，主要包括IRS-1和IRS-2，可以將INSR和多種效應分子進行連接，參與胰島素信號轉(zhuǎn)導通路及其代謝，并在胰島素受體后水平發(fā)揮重要作用[10]。INSR的α亞基和β亞基在信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮系列的功效。首先INSR的α亞基與胰島素結(jié)合，其次INSR的β亞基酪氨酸殘基自身發(fā)生磷酸化，導致IRS多個酪氨酸殘基相繼發(fā)生磷酸化。IRS蛋白只有發(fā)生磷酸化反應，才能發(fā)揮生理作用，即IRS能為下游蛋白提供結(jié)合位點，這種位點親和度高。下游含有特定功能域的信號蛋白很快與具有高親和力的位點結(jié)合，并激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，含有特定結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)將與之進行結(jié)合，并被激活，該蛋白被激活后，級聯(lián)信號即被啟動，信號繼續(xù)傳遞，進一步激活下游效應分子，介導代謝反應、細胞生存、生長和分化的多重功效?？梢奍RS及其磷酸化過程，在胰島素的代謝過程中尤為重要。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，PCOS組子宮內(nèi)膜組織IRS-1和IRS-2蛋白表達及蛋白酪氨酸磷酸化程度均下降，差異有統(tǒng)計學意義。由于IRS是胰島素受體后信號傳導通路的重要蛋白，IRS蛋白異常表達及酪氨酸磷酸化程度下降，使IRS不能正常發(fā)揮生理作用，進而導致子宮內(nèi)膜胰島素通路傳導出現(xiàn)障礙，影響下游效應蛋白啟動，進一步影響子宮內(nèi)膜的胰島素代謝和葡萄糖的攝取和利用，提示IRS參與子宮內(nèi)膜水平細胞的代謝受損。推測PCOS組子宮內(nèi)膜IRS蛋白表達量減少及酪氨酸磷酸化程度下降,導致子宮內(nèi)膜組織對葡萄糖攝取、利用的減少是子宮內(nèi)膜水平胰島素抵抗的重要基礎，在PCOS子宮內(nèi)膜組織產(chǎn)生IR。本研究結(jié)果還顯示，PCOS組中伴IR者的IRS-1及IRS-2蛋白的表達下降程度和蛋白酪氨酸磷酸化異常程度較PCOS非IR組相比，差異有統(tǒng)計學意義。提示IRS的異常表達及蛋白酪氨酸磷酸化程度下降與IR的發(fā)生存在密切的關(guān)聯(lián)，IR和IRS蛋白表達異常及蛋白酪氨酸磷酸化程度下降可能互為因果。

子宮內(nèi)膜作為重要的生殖單位，需對胚胎著床提供葡萄糖[11]，是胚胎著床的基礎。伴隨IRS表達異常及蛋白酪氨酸磷酸化程度下降，PCOS子宮內(nèi)膜后續(xù)會出現(xiàn)代謝異常和功能異常，降低糖原合成和能量供給，使子宮內(nèi)膜的發(fā)育出現(xiàn)異常，影響胚胎植入，這或許可以解釋PCOS患者高促排卵率、低妊娠率。在臨床工作中，通過有效地改善PCOS患者子宮內(nèi)膜胰島素抵抗的治療，可能提高PCOS患者的受孕率，有待進一步的研究。(本文圖見封二)

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(本文編輯：劉斯靜)

EXPRESSIONOFINSULINRECEPTORSUBSTRATEINENDOMETRIUMOFPATIENTSWITHPOLYCYSTICOVARYSYNDROME

WANGWei1,HUATian2,CAOJinfeng1,HAOGuimin1,CUINa1,JIANGLei1
(1.DepartmentofReproductionMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;2.DepartmentofGynecology,XingtaiPeople′sHospital,HebeiProvince,Xingtai054031,China)

CT:ObjectiveToresearchtheexpressionofproteininsulinreceptorsubstrate(IRS)andtheleveloftyrosinephosphorylationintheendometriumofthepatientswithpolycysticovarysyndrome(PCOS)andinvestigatethecorrelationsbetweentheexpressionsandtheresistanceofinsulin.MethodsThirtypatientswithPCOSservedasexperimentalgroupaccordingtothediagnosticcriteria,and30femaleshospitalizedsynchronouslywithregularmenstrualcycle,normalserumsexhormone,fastingplasmaglucoseandfastinginsulinlevelsascontrolgroup.Accordingtothehomeostasismodelassessmentforinsulinresistance,thePCOSgroupwasdividedintotwogroups,insulinresistancegroup(groupIR) 17casesandnoninsulinresistancegroup(groupNIR) 13cases.ThedifferencesintheexpressionofIRS-1andIRS-2byimmunohistochemistryamonggroupIR,groupNIRandcontrolgroup,andthelevelsoftyrosinephosphorylationofIRS-1andIRS-2amongthethreegroupswerecompared.ResultsTheexpressionsofproteinIRS-1andIRS-2andthelevelsoftyrosinephosphorylationofIRS-1andIRS-2inPCOSgroupweresignificantlyweakerthanthoseincontrolgroup(P<0.05).TheexpressionsofproteinIRS-1andIRS-2andthelevelsoftyrosinephosphorylationofIRS-1andIRS-2inthePCOSgroupwithIRwereobviouslyweakerthanthoseinthePCOSgroupwithoutIR(P<0.05).ConclusionItisobviousthattheexpressionsofproteinIRS-1andIRS-2declinedandthedegreesoftyrosinephosphorylationdescendedinthepatientswithPCOS.TheabnormalityisquitedistinctinthepatientsofPCOSgroupwithIR.ItspeculatesthatthereisacloserelationshipbetweentheabnormalexpressionofIRS,thedescentofthedegreeoftyrosinephosphorylationandthegenesisofIRintheendometriumofthepatientswithPCOS.

polycysticovarysyndrome；receptor,insulin;endometrium

2014-03-20；

2014-05-15

河北省科學技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(11276103D-29)；河北省人口和計劃生育委員會科研計劃項目(2013-A06);河北、醫(yī)科大學第二醫(yī)院科研基金項目(2h1201308)

王瑋(1974-)，女，河北深縣人，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，從事人類輔助生殖技術(shù)研究。

R711.75

A

1007-3205(2014)07-0745-04