孫東良，王麗娜，劉永亮，王麗娟，王 鵬(.河北省唐山市曹妃甸區(qū)醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 0600；.河北省唐山市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 06000；.河北省唐山市豐潤區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 06000)

·論著·

丁苯酞對彌漫性腦損傷大鼠腦水腫及皮層基質(zhì)金屬蛋白酶9、咬合蛋白表達的影響

孫東良1，王麗娜2，劉永亮2，王麗娟3，王 鵬2
(1.河北省唐山市曹妃甸區(qū)醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 063200；2.河北省唐山市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 063000；3.河北省唐山市豐潤區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 063000)

目的探索丁苯酞對彌漫性腦損傷大鼠模型腦水腫及皮層基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、咬合蛋白表達的影響。方法Sprague-Dawley 雄性大鼠140只，隨機分為對照組和丁苯酞組(40mg/kg，1次/d)各70只。應(yīng)用Marmarou法建立彌漫性腦損傷大鼠模型。2組分別于術(shù)后6、12、24、72、144h采用干濕質(zhì)量法檢測大鼠腦組織含水量變化，采用免疫組織化學(xué)檢測損傷區(qū)周圍皮層MMP-9和咬合蛋白表達變化。2組分別于術(shù)后6、24、72、144h采用Western blot法檢測損傷區(qū)周圍皮層MMP-9和咬合蛋白含量變化。結(jié)果與對照組比較，丁苯酞組腦組織含水量降低，損傷區(qū)周圍皮層MMP-9表達減少(P<0.05)，咬合蛋白表達增多(P<0.05)。結(jié)論丁苯酞可降低彌漫性腦損傷大鼠皮層MMP-9的表達，增加咬合蛋白的表達，減輕腦水腫的形成。

腦損傷；腦水腫；基質(zhì)金屬蛋白酶9；丁苯酞

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.07.004

丁苯酞是我國自行研制的一類治療缺血性腦血管病的新藥，對急性腦梗死有明顯的治療作用[1]。為弄清丁苯酞的作用機制，本研究觀察了丁苯酞對顱腦損傷大鼠腦水腫及損傷區(qū)周圍皮層基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)、咬合蛋白表達的影響，旨在為丁苯酞在顱腦損傷中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動物分組：健康Sprague-Dawley雄性大鼠140只，清潔級,體質(zhì)量280～320g，由河北聯(lián)合大學(xué)實驗動物中心提供。按照隨機數(shù)字表法分為對照組和丁苯酞組各70只。分別于6、12、24、72 、144h行腦組織含水量測定和免疫組織化學(xué)檢測，每個時間點5只，腦組織含水量每組25只，免疫組織化學(xué)每組25只。2組再分別于6、24、72、144h行Westernblot檢測，每個時間點5只，Westernblot每組20只。

1.2 模型制備和給藥方法：參考Marmarou法[2]制作大鼠彌漫性腦損傷模型。乙醚麻醉動物(麻醉時間為70～150s)，將麻醉好的大鼠俯臥位固定于海綿床墊(10cm×20cm×30cm)上，將質(zhì)量450g、直徑18mm的銅棒自1.5m高度垂直落下撞擊置于大鼠冠狀縫與失狀縫正中的不銹鋼墊，造成大鼠彌漫性顱腦損傷。丁苯酞組大鼠從致傷后30min起給予丁苯酞軟膠囊植物油溶液，藥物劑量按40mg/kg灌胃，1次/d，直至各時間點處死。對照組給予等量植物油。

1.3 腦組織含水量測定：隨機選取2組各時間點大鼠各5只，以10%水合氯醛麻醉，斷頭處死，開顱取腦，從損傷區(qū)周圍取200mg腦組織，應(yīng)用MA110電子分析天平(上海第二天平儀器廠)稱濕質(zhì)量并記錄后置于105℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥48h至恒質(zhì)量，分析比較2組大鼠腦組織含水量變化。腦含水量稱干質(zhì)量后按Elliot公式計算，腦含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.4 免疫組織化學(xué)染色：隨機選取2組各時間點大鼠各5只，深度麻醉后開胸,4%多聚甲醛灌注,斷頭取腦,置于4%多聚甲醛液中4℃冰箱過夜至組織塊沉底。冠狀切取2mm厚包含損傷區(qū)域及左右半球的組織塊浸于4%多聚甲醛中再固定4h。經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。將石蠟包埋的組織塊取出放入切片機中做連續(xù)切片,片厚5μm。取各大鼠等部位切片3張，經(jīng)二甲苯二級脫蠟各5min，梯度酒精脫水，3%雙氧水室溫10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶，高壓熱修復(fù)，后分別滴加1∶100比例稀釋的抗MMP-9一抗和1∶200比例稀釋的抗咬合蛋白一抗，4℃過夜，次晨取出置常溫，磷酸鹽緩沖液沖洗后，滴加二抗，37℃孵育1h，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色，水沖洗后蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察細胞核呈藍色，陽性細胞腫脹，包漿黃染。在200倍顯微鏡下在傷灶周圍隨機選取5個視野，用美國MediaCybernetics公司生產(chǎn)的Image-Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)照相后計算每個視野中陽性細胞數(shù)目。

1.5Westernblot法：用細胞裂解液提取2組各時間點大鼠損傷區(qū)周圍腦組織總蛋白，運用考馬·斯亮藍比色法測定各個樣本蛋白含量，上樣量為100μg蛋白。進行15%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉；山羊抗MMP-9多克隆一抗(1∶500稀釋)，山羊抗咬合蛋白多克隆一抗(1∶500稀釋)，山羊抗actin多克隆一抗(1∶1 000稀釋)，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶1 000稀釋)進行雜交。EcL發(fā)光劑3min，曝光，顯影，定影。采用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對Westemblot結(jié)果進行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 腦組織含水量：對照組和丁苯酞組腦損傷后腦組織中含水量逐漸增加，24h達到高峰，72h緩慢下降，144h基本達到6h水平(P<0.05)。與對照組相比，丁苯酞組大鼠腦組織含水量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

GroupsCorticalwatercontent(%)6h12h24h72h144hFPControl74．16±0．23 75．55±0．24?79．30±0．27?#78．05±0．25?#△73．10±0．18#△☆33．8320．000Butylphthalide73．63±0．26?74．78±0．25?77．54±0．27?#76．23±0．26?#△72．38±0．25#△☆317．1880．000 t3．4034．91910．46711．4285．254 P0．0090．0010．0000．0000．001

*P<0.05vs6h #P<0.05vs12h △P<0.05vs24h ☆P<0.05vs72h byqtest

2.2 MMP-9免疫組織化學(xué)結(jié)果：腦損傷后對照組和丁苯酞組MMP-9陽性細胞(被染成棕黃色)數(shù)均隨時間延長逐漸增加，24h達到高峰，72h開始減少，144h基本達到6h水平(P<0.05)。丁苯酞組每個時點MMP-9陽性細胞數(shù)均較對照組明顯減少(P<0.05或<0.01)。見表2。

GroupsMMP?9(cells/HP)6h12h24h72h144hFPControl28．60±2．7055．40±3．21?111．80±2．95?#75．80±2．86?#△27．40±3．21#△☆697．9020．000Butylphthalide23．00±2．9241．80±2．59?86．20±1．92?#48．00±4．58?#△22．00±2．55#△☆367．2520．000 t3．1507．37616．25611．5042．946 P0．0140．0000．0000．0000．019

*P<0.05vs6h #P<0.05vs12h △P<0.05vs24h ☆P<0.05vs72h byqtest

2.3 咬合蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果:腦損傷后對照組和丁苯酞組咬合蛋白陽性細胞(被染成棕黃色)數(shù)隨時間延長逐漸減少，24h減到最低，72h開始增加，144h基本達到6h水平(P<0.05)。丁苯酞組每個時點咬合蛋白陽性細胞數(shù)均較對照組明顯增多(P<0.05或<0.01)。見表3。

GroupsOccludin(cells/HP)6h12h24h72h144hFPControl29．80±0．4517．20±2．59?10．00±2．65?#15．60±1．14?△30．80±2．95#△☆88．2760．000Butylphthalide32．40±1．5226．40±1．14?18．60±1．82?#25．60±0．55?△33．60±0．89#△☆113．3500．000 t3．6777．2735．99217．6782．031 P0．0160．0010．0000．0000．047

*P<0.05vs6h #P<0.05vs12h △P<0.05vs24h ☆P<0.05vs72h byqtest

2.4 MMP-9 Western bolt結(jié)果: 腦損傷后對照組和丁苯酞組MMP-9蛋白表達均隨時間延長逐漸增加，24h達到高峰，72h后開始減少(P<0.05)。丁苯酞組每個時點MMP-9蛋白表達均較對照組明顯減少(P<0.01)。見表4、圖1。

GroupsMMP?9(%)6h12h24h72h144hFPControl28．97±1．08 77．52±0．60?65．37±0．47?#34．59±0．54?#△5423．7010．000Butylphthalide24．36±0．8654．53±0．68?39．23±0．80?#26．85±1．29?#△1093．4800．000t7．46256．75363．16312．386P0．0000．0000．0000．000

*P<0.05vs6h #P<0.05vs24h △P<0.05vs72h byqtest

2.5 咬合蛋白Western bolt結(jié)果:腦損傷后對照組和丁苯酞組咬合蛋白表達隨時間延長逐漸減少，24h減到最低，72h開始增加，144h達到最高水平(P<0.05)。丁苯酞組每個時點咬合蛋白表達均較對照組明顯增多(P<0.01)。見表5、圖1。

GroupsOccludin(%)6h24h72h144hFPControl186．87±0．71146．26±0．81?164．50±0．61?#197．03±0．61?#△5458．9310．000Butylphthalide204．41±0．82168．54±0．81?190．76±0．50?#211．30±1．12?#△2518．0880．000 t36．04643．71274．60325．080 P0．0000．0000．0000．000

*P<0.05vs6h #P<0.05vs24h △P<0.05vs72h byqtest

圖1 Western bolt檢測損傷區(qū)周圍皮層MMP-9和咬合蛋白表達

1.對照組6h；2.對照組24h；3.對照組72h；4.對照組144h；.5.丁苯酞組6h；6.丁苯酞組24h；7.丁苯酞組72h；8.丁苯酞組144h

Figure 1 MMP-9 and occludin Western blot results

1.Control group 6h；2.Control group 24h；3.Control group 72h；4.Control group 144h；5.Butylphthalide group 6h；6.Butylphthalide group 24h；7.Butylphthalide group 72h；8.Butylphthalide group 144h

3 討 論

丁苯酞是一類治療急性缺血性腦血管病的新藥。既往研究[3-5]表明，丁苯酞具有改善腦微循環(huán)，增加腦血流量，抑制炎癥反應(yīng)，保護線粒體，改善腦組織能量代謝，減輕自由基損傷，抑制氧化應(yīng)激，保護血腦屏障，抑制神經(jīng)細胞凋亡等作用。提示丁苯酞可減輕腦水腫的形成。而顱腦損傷后腦水腫的形成，是引起腦損傷后繼發(fā)死亡的主要原因。本研究結(jié)果示，腦損傷后6h腦水腫即開始形成，24h達高峰，72h開始緩解，144h腦水腫明顯緩解；而丁苯酞組腦組織含水量較對照組明顯減少。提示丁苯酞對腦損傷后腦水腫有明顯的治療作用。

MMP是一種鋅離子依賴性蛋白酶，主要參與調(diào)解細胞外的基質(zhì)成分，臨床上主要參與動脈粥樣硬化、腫瘤轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)等病理過程[6]。其中MMP-9主要存在于腦組織中，與腦血管病的關(guān)系最為密切。MMP-9可通過攻擊腦血管外基膜的主要成分層黏蛋白和纖黏蛋白，破壞血腦屏障，導(dǎo)致血腦屏障通透性增高，從而加重腦水腫的形成。而本研究表明腦損傷發(fā)生后MMP-9表達明顯增加，丁苯酞組MMP-9表達明顯減少。提示丁苯酞可減少MMP-9的表達。Gidday等[7]發(fā)現(xiàn)白細胞，特別是中性粒細胞是腦組織中MMP-9的主要來源，而MMP-9能促進白細胞的募集，造成繼微血管基底膜層黏蛋白水解后血腦屏障通透性的破壞，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷。當(dāng)顱腦損傷發(fā)生后繼發(fā)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致中性粒細胞數(shù)目增多，MMP-9生成增多。而丁苯酞具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。炎性細胞因子和C反應(yīng)蛋白參與急性腦梗死的病理過程[8]。朱海生等[9]研究表明，丁苯酞具有抑制慢性腦供血不足患者血清C反應(yīng)蛋白表達的作用。推測丁苯酞可能是通過抑制炎癥反應(yīng)來減少MMP-9表達的。

咬合蛋白是血管內(nèi)皮緊密連接的主要組成部分。郭平等[10]認為咬合蛋白的磷酸化狀態(tài)與緊密連接功能的維持密切相關(guān)。當(dāng)咬合蛋白破壞時，緊密連接屏障功能受損，血腦屏障通透性增高，腦水腫形成。本研究結(jié)果表明，腦損傷發(fā)生后，損傷區(qū)周圍皮層咬合蛋白含量明顯下降，而丁苯酞可提高咬合蛋白的表達。MMP-9的表達與咬合蛋白的表達趨勢正好相反，我們認為顱腦損傷后通過炎癥反應(yīng)激活了MMP-9，進而降解了血管內(nèi)皮緊密連接中的咬合蛋白，從而導(dǎo)致了腦水腫的形成。而丁苯酞具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，可減少MMP-9的激活，從而減少咬合蛋白的破壞。此外，Seth等[11]研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，也可導(dǎo)致咬合蛋白發(fā)生磷酸化。腦損傷發(fā)生后引起的應(yīng)激反應(yīng)及缺血缺氧均可引起細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，從而使咬合蛋白磷酸化，緊密連接屏障功能受損。而鄢學(xué)芬等[12]研究表明，丁苯酞可降低神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。我們認為丁苯酞可能通過改善腦微循環(huán)，保護線粒體，改善缺血區(qū)的能力代謝，降低細胞內(nèi)的鈣離子濃度，從而減輕咬合蛋白的磷酸化。

綜上所述，丁苯酞可減輕彌漫性腦損傷大鼠腦水腫的形成，對腦損傷有一定的治療作用。丁苯酞可能是通過減少梗死灶周圍MMP-9的表達，減輕MMP-9對腦血管緊密連接中咬合蛋白降解，減輕血腦屏障的破壞，從而減輕腦水腫的形成。

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(本文編輯：許卓文)

EFFECTOFBUTYLPHTHALIDEONBRAINEDEMAOFRATSAFTERFOCALCEREBRALINFARCTIONANDEXPRESSIONOFCORTICALMATRIXMETALLOPROTEINASE-9ANDOCCLUDIN

SUNDongliang1,WANGLina2,LIUYongliang2,WANGLijuan3,WANGPeng2
(1.DepartmentofNeurosurgery,CaofeidianHospitalofTangshanCity,HebeiProvince,Tangshan063000,China;>2.DepartmentofNeurosurgery,thePeople′sHospitalofTangshanCity,HebeiProvince,Tangshan063000,China;3.DepartmentofLaboratory,FengrunSecondPeople′sHospitalofTangshanCity,HebeiProvince,Tangshan063000,China)

CT:ObjectiveToexploretheeffectofbutylphthalideonthebrainedemaofratsfollowingtraumaticbraininjuryandtheexpressionofcorticalmatrixmetalloproteinase-9(MMP-9)andoccludinaroundtheinjuryarea.MethodsOnehundredandfortySprague-Dawleymaleratsweredividedintocontrolgroupandbutylphthalidegroup(40mg/kg，onceaday).ThemodelwasmadebyMarmaroumethod.Afterinjury6h,12h,24h,72hand144h,brainwatercontentwasmeasuredtoobservethechangesofthebrainedema,theimmunohistochemistryandWesternblotwereusedtoobservetheexpressionofMMP-9andoccludinaroundtheinjuryarea.ResultsComparedwiththecontrolgroup,thebrainwatercontentofthebutylphthalidegroupwasless,thecontentofMMP-9aroundtheinjuryareadecreasedsignificantly(P<0.05).Andthecontentofoccludinaroundtheinjuryareaincreased(P<0.05).ConclusionButylphthalidecouldreducetheexpressionofMMP-9followingtraumaticbraininjury,increasetheexpressionofMMP-9,andreducethebrainedema.

braininjuries;brainedema;matrixmetalloproteinase9;butylphthalide

2013-11-18；

2014-02-14

河北省衛(wèi)生廳科研基金項目(20130384)

孫東良(1972-)，男，河北唐山人，河北省唐山市曹妃甸區(qū)醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事神經(jīng)外科疾病診治研究。

R651.15

A

1007-3205(2014)07-0756-05