董 惠，王小新，吳力娟，段偉松，許 蕾*(.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北省神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050000；.北京市密云縣醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 密云 0500；.河北省邢臺市第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 邢臺 054000)

·論著·

突變和野生型TDP-43對運(yùn)動神經(jīng)元電壓門控鈉通道的影響

董 惠1，王小新2，吳力娟3，段偉松1，許 蕾1*
(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北省神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050000；2.北京市密云縣醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 密云 101500；3.河北省邢臺市第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 邢臺 054000)

目的觀察反式激活應(yīng)答區(qū)域DNA結(jié)合蛋白43(transactivating response region DNA binding protein，TDP-43)對運(yùn)動神經(jīng)元電壓門控鈉離子通道(voltage-gated sodium channels，VGSCs)特性的影響，評價突變(M337V)和野生型TDP-43與運(yùn)動神經(jīng)元變性的關(guān)系。方法選擇運(yùn)動神經(jīng)元樣細(xì)胞系，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空的pCI-neo質(zhì)粒(對照組)或者攜帶M337V突變(M337V組)和人野生型(WT組)TDP-43 cDNA的質(zhì)粒；采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄M337V組、WT組和對照組3類細(xì)胞VGSCs激活和失活電流，分析VGSCs特性的變化。結(jié)果WT組VGSCs激活曲線的半數(shù)激活電壓以及緩慢失活后恢復(fù)曲線的時間常數(shù)明顯小于M337V組和對照組(P<0.05或<0.01)，提示野生型TDP-43加快了VGSCs激活和慢失活恢復(fù)的特性；而M337V組VGSCs穩(wěn)態(tài)失活曲線的半數(shù)失活電壓以及快速失活后恢復(fù)曲線的時間常數(shù)明顯大于WT組和對照組(P<0.05或<0.01)，提示M337V突變TDP-43抑制運(yùn)動神經(jīng)元樣細(xì)胞VGSCs快速失活和激活后恢復(fù)能力。結(jié)論M337V突變或人野生型TDP-43可導(dǎo)致VGSCs功能改變，增高運(yùn)動神經(jīng)元興奮性，但二者從不同角度影響VGSCs的特性，提示這兩種TDP-43通過不同的機(jī)制介導(dǎo)和參與運(yùn)動神經(jīng)元變性。

運(yùn)動神經(jīng)元；DNA結(jié)合蛋白質(zhì)類；鈉通道,電壓門控

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.07.021

反式激活應(yīng)答區(qū)域DNA結(jié)合蛋白43(transactivating response region DNA binding protein，TDP-43)是大多數(shù)肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)和額顳葉癡呆(frontotemporal lobar degeneration,FTLD)患者泛素化包涵體的主要成分[1]。編碼TDP-43的基因TARDBP與散發(fā)型和家族型ALS相關(guān)[2-3]，提示TDP-43的改變可直接引起神經(jīng)元變性。臨床研究[4-7]顯示，ALS患者皮層運(yùn)動神經(jīng)元興奮性增加同時皮層間抑制減小，甚至這種高興奮性是散發(fā)型ALS的早期特點(diǎn)，也可預(yù)示家族型ALS的臨床發(fā)病，但是TDP-43如何影響運(yùn)動神經(jīng)元興奮水平還不清楚。細(xì)胞產(chǎn)生動作電位的能力被稱為興奮性，電壓門控鈉離子通道(voltage-gated sodium channels，VGSCs)是可興奮細(xì)胞暴發(fā)動作電位以及動作電位延細(xì)胞膜傳遞的關(guān)鍵，其激活和失活功能改變直接影響細(xì)胞興奮水平。本研究通過觀察表達(dá)人類突變(M337V)和野生型TDP-43的運(yùn)動神經(jīng)元樣細(xì)胞VGSCs性質(zhì)的改變，探討VGSCs在TDP-43所致神經(jīng)元變性中的作用。

1 材料與方法

1.1 建立穩(wěn)定表達(dá)突變和人野生型TDP-43的運(yùn)動神經(jīng)元樣細(xì)胞系:NSC34細(xì)胞是一種保留增殖功能和表達(dá)多種運(yùn)動神經(jīng)元特性的雜交細(xì)胞系。NSC34細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pCl-neo空質(zhì)粒(對照組)、克隆人類野生型TDP-43 cDNA質(zhì)粒(WT組)和克隆人M337V突變的TDP-43 cDNA質(zhì)粒(M337V組)，3類質(zhì)粒均攜帶HA標(biāo)簽，轉(zhuǎn)染方法與我們以往的研究[8]相同。

1.2 VGSCs的記錄:采用全細(xì)胞模式電壓鉗方法記錄對照組、WT組和M337V組NSC34細(xì)胞的VGSCs電流(INa)，將硼硅酸玻璃電極拉制成電阻4～6MΩ的微電極，尖端熱拋光處理。電極內(nèi)液,130mmol/L CsCl,20mmol/L氯化四乙胺,1mmol/L MgCl2,0.24mmol/L CaCl2,10mmol/L右旋葡萄糖,5mmol/L乙二醇雙四乙酸,2mmol/L三磷酸腺苷二鈉,10mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸，用CsOH調(diào)pH值至7.2～7.3。細(xì)胞外液成分為120mmol/L NaCl,3mmol/L KCl,2mmol/L MgCl2,2mmol/L CaCl2,10mmol/L右旋葡萄糖,10mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸,用NaOH調(diào)pH值至7.2～7.3，加入0.2mmol/L氯化鉻和1mmol/L 4-氨基吡啶阻滯Ca2+和K+電流。所有試劑均購自Sigma公司。整個實(shí)驗(yàn)過程在室溫(22～24°C)條件下進(jìn)行，當(dāng)電極尖端接觸到細(xì)胞膜時，釋放正壓并稍施負(fù)壓形成封接(電阻>2GΩ)，吸破細(xì)胞膜，膜片鉗放大器(德國HEKA EPC10)Patchmaster記錄到膜電流，表明細(xì)胞膜已經(jīng)吸破而形成全細(xì)胞記錄模式，記錄細(xì)胞電容(C)，電容和串聯(lián)電阻的補(bǔ)償>85%，采用頻率為50kHz。形成全細(xì)胞記錄模式后，將電位鉗制在-100mV，待電流穩(wěn)定，去極化到-10mV時長為10ms，可記錄到一個快速激活快速失活的內(nèi)向電流，此電流可以被1μmol/L河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX，Sigma，美國)完全阻斷，證實(shí)為TTX敏感型INa。每個細(xì)胞所記錄到的電流除以自身電容(INa/C)，得到單位表面積上電流的大小，即電流密度(pA/pF)，以減少誤差。

1.3 INa數(shù)據(jù)擬合和性質(zhì)分析:VGSCs電壓依賴的激活和穩(wěn)態(tài)失活，均采用Boltzmann方程進(jìn)行擬合，I/C=1-{1/[1+exp(V-V1/2)/k]}，其中I/C代表電流密度，V代表刺激電壓，V1/2是半數(shù)激活或失活電壓，k為曲線斜率，這些參數(shù)表現(xiàn)了VGSCs激活和失活電壓依賴性的特征。VGSCs快速失活恢復(fù)以及慢失活恢復(fù)，均采用單指數(shù)方程進(jìn)行擬合，I△t/Imax=A1×exp(-t/τ)，其中I△t代表電流峰值，A1代表時間常數(shù)τ對應(yīng)的電流恢復(fù)比例，t代表時間，Imax代表第1個去極化電流的幅度。

2 結(jié) 果

2.1 VGSCs激活的電壓依賴性：電位鉗制在-100mV，給予-60～+45mV的階梯去極化脈沖刺激，步幅為5mV，刺激時長為10ms，每兩個刺激循環(huán)之間的時間間隔為500ms，可以記錄到一系列VGSCs電流(圖1A，B)。

電流密度-電壓(INa-V)曲線(圖1C)顯示，對照組(n=12)、WT組(n=17)和M337V組(n=16)均存在電壓依賴性，在-35mV脈沖刺激時可激活VGSCs產(chǎn)生INa，隨著刺激電壓的增大，INa也逐漸增大，在刺激電壓為-10mV時INa達(dá)到峰值，分別是-95.00±8.83、-81.36±10.62和-81.92±10.86pA/pF，3組細(xì)胞的峰值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，3組細(xì)胞在達(dá)到峰值后逐漸減小，刺激電壓從-35～+45mV所對應(yīng)的對照組細(xì)胞INa是從-10.04±9.61～-34.53±5.36pA/pF，WT組是從-26.25±16.61～-42.18±7.56pA/pF，M337V組是從-13.60±9.69～-29.50±6.36pA/pF，3組間各個刺激電壓所對應(yīng)的INa比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

將3組細(xì)胞-50～-5mV所對應(yīng)的INa進(jìn)行Boltzmann方程擬合(圖1D)。對照組、WT組和M337V組半數(shù)激活電壓V1/2分別為-28.04±0.35、-32.75±0.69、-28.93±0.38mV，其中WT組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，M337V組與WT組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而M337V組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對照組、WT組和M337V組的斜率κ分別為3.68±0.31、3.58±0.62和3.81±0.35，3組之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1E)。

圖1 VGSCs激活的電壓依賴性(電流密度-電壓曲線)

*P<0.05與WT組比較 #P<0.05與對照組比較(q檢驗(yàn))
A.電壓刺激模式圖;B.M337V組,WT組和對照組細(xì)胞的VGSCs電流圖;C.3組VGSCs電流密度-電壓曲線;D.3組VGSCs激活擬合曲線;E.3組半數(shù)激活電壓V1/2和斜率k

2.2 VGSCs的穩(wěn)態(tài)失活：鉗制電壓-100mV，給予從-100～-20mV時長為40ms系列預(yù)刺激，步幅為10mV，再去極化到+10mV，時長10ms，最后恢復(fù)到鉗制電壓，每個循環(huán)間隔500ms(圖2A)。圖2B顯示記錄到的對照組、WT組和M337V組VGSCs電流。預(yù)刺激為-100mV時對應(yīng)的電流最大(Imax)，其他預(yù)刺激所對應(yīng)的INa除以Imax得到電流比例值(I/Imax)，對3組I/Imax值進(jìn)行Boltzmann方程擬合得到圖2C。可見對照組、WT組和M337V組均隨著預(yù)刺激電壓的增大VGSCs逐漸失活，至-20mV時VGSCs完全失活。在預(yù)刺激電壓為-50、-40和-30mV時，WT組細(xì)胞I/Imax值分別為0.60±0.08、0.29±0.10和0.08±0.07，對照組分別為0.58±0.05、0.31±0.06和0.08±0.04，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在預(yù)刺激電壓為-40和-30mV時M337V組I/Imax值分別為0.70±0.04，0.46±0.07和0.13±0.06，明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

對照組、WT組和M337V組半數(shù)失活電壓V1/2分別為-45.61±0.97、-45.98±0.65和-36.81±0.92mV，M337V組較WT組和對照組均有明顯的增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組、WT組和M337V組的斜率k分別為10.60±0.83、9.33±0.56和12.11±0.56，M337V組較WT組和對照組均有明顯的增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2D)。

圖2 VGSCs穩(wěn)態(tài)失活

*P<0.05與WT組比較 #P<0.05與對照組比較(q檢驗(yàn))
A.電壓刺激模式圖;B.M337V組,WT組和對照組細(xì)胞VGSCs穩(wěn)態(tài)失活電流圖;C.3組VGSCs穩(wěn)態(tài)失活擬合曲線;D.3組半數(shù)失活電壓V1/2和斜率k

2.3 VGSCs快速失活的恢復(fù)：鉗制電位-100mV，給予去極化到-10mV時長10ms的方波刺激，間隔后給予同樣的方波刺激，2個方波之間的間隔時間從0.5ms開始，每個循環(huán)增加0.5ms，逐漸遞增至最大間隔45ms(圖3A)。圖3B顯示記錄到的對照組、WT組和M337V組VGSCs快速恢復(fù)電流。

每個循環(huán)，均以第二個方波刺激所引出的電流峰值(I)除以第一個方波刺激所引出的電流峰值(Imax)，得到比例值(I/Imax)，以I/Imax值與對應(yīng)的時間間隔作圖，并對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單指數(shù)方程擬合，得到圖3C，顯示M337V組與對照組比較曲線右移。對照組、WT組和M337V組VGSCs的快速失活恢復(fù)的時間常數(shù)(τ)分別為5.62±0.10、6.47±0.14和7.42±0.08ms，其中M337V組與對照組比較有明顯的增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖3D)。

圖3 VGSCs快速失活的恢復(fù)

*P<0.01與對照組比較(q檢驗(yàn))
A.電壓刺激模式圖;B.M337V組,WT組和對照組細(xì)胞VGSCs快速失活后恢復(fù)的電流圖;C.3組VGSCs快速失活后恢復(fù)的擬合曲線;D.3組VGSCs快速失活后恢復(fù)的時間常數(shù)τ

2.4 VGSCs緩慢失活的恢復(fù)：鉗制電壓-100mV，給予-10mV、10s長時程方波刺激，間隔1s以使所有鈉通道從快速失活狀態(tài)恢復(fù)，再給予1個-10mV，5ms的短時程刺激，檢測鈉通道進(jìn)入緩慢失活狀態(tài)所占的比例，之后每間隔3s再次給予相同的短時程刺激，直到總間隔時間為25s(圖4A)。

以長時程刺激所得到的電流幅度值為Imax，隨后的不同時間間隔的短時程刺激得到的電流幅度(I)除以Imax，得到I/Imax。以間隔時間為橫坐標(biāo)，對1～25s對應(yīng)的I/Imax值進(jìn)行單指數(shù)方程擬合制成圖4B，顯示在間隔時間為1和4s時WT組I/Imax值(0.72±0.03vs0.90±0.02)明顯大于對照組(0.50±0.03和0.80±0.02)和M337V組(0.48±0.04和0.80±0.02)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或<0.05)。

對照組、WT組和M337V組緩慢失活恢復(fù)的時間常數(shù)(τ)分別為3.30±0.31、1.94±0.14和3.25±0.24s，WT組明顯小于M337V組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖4C)。

圖4 VGSCs緩慢失活的恢復(fù)

*P<0.01與WT組比較 #P<0.01與對照組比較(q檢驗(yàn))
A.電壓刺激模式圖;B.M337V組,WT組和對照組細(xì)胞VGSCs緩慢失活恢復(fù)的擬合曲線;C.3組VGSCs緩慢失活恢復(fù)的時間常數(shù)τ

3 討 論

人TDP-43是一種高保守、普遍存在的核蛋白，可結(jié)合DNA和RNA[9]，主要參與RNA的代謝，包括剪切、轉(zhuǎn)錄抑制、miRNA的合成、mRNA胞核胞漿穿梭，以及RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和穩(wěn)定[10]，它的功能障礙可導(dǎo)致其下游多種功能蛋白異常，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)超過40種TDP-43的結(jié)構(gòu)域突變與家族性或散發(fā)性ALS相關(guān)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)TDP-43 M337V突變的運(yùn)動神經(jīng)元VGSCs激活后穩(wěn)態(tài)失活速度以及快速失活后的恢復(fù)速度均明顯減慢。提示M337V突變的TDP-43主要影響運(yùn)動神經(jīng)元樣細(xì)胞VGSCs失活和激活后恢復(fù)的過程。VGSCs失活和激活后恢復(fù)能力的下調(diào)，必然會導(dǎo)致神經(jīng)元動作電位時間特性的改變，重要的是在神經(jīng)信號的傳導(dǎo)過程中，動作電位頻率和時間特性在編碼神經(jīng)沖動中起關(guān)鍵作用[12]，即使很小的改變也可能導(dǎo)致神經(jīng)元間信息傳遞異常，進(jìn)而影響正常生理過程。

然而大部分的ALS和FTLD患者都沒有合并TDP-43突變，同時有研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)人類野生型TDP-43的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出脊髓和皮層運(yùn)動神經(jīng)元變性，野生型TDP-43可下調(diào)內(nèi)源性TDP-43，導(dǎo)致TDP-43蛋白截斷和聚集，最終提高胞漿和胞核泛素化水平、線粒體異常聚集以及軸索變性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)人類野生型TDP-43的運(yùn)動神經(jīng)元樣細(xì)胞VGSCs半數(shù)激活電壓減小，說明細(xì)胞膜電位去極化較小的范圍即可使50%VGSCs開放。同時這類細(xì)胞VGSCs進(jìn)入緩慢失活的比例明顯減少，其隨后緩慢失活恢復(fù)的速度也明顯高于M337V組和對照組，均提示表達(dá)人類野生型TDP-43可使運(yùn)動神經(jīng)元易產(chǎn)生動作電位，處于一種高興奮水平，進(jìn)而加重氧化應(yīng)激[15]，改變線粒體功能[16]導(dǎo)致能量耗竭，推進(jìn)臨床癥狀的發(fā)展。同樣臨床研究[17]也證實(shí)，無論是家族性還是散發(fā)性ALS患者均表現(xiàn)出皮層高興奮性，推測細(xì)胞膜離子通道功能變化損害了沿運(yùn)動皮層傳導(dǎo)的抑制和興奮通路，并且這種損害與病程和臨床分期有關(guān)。

VGSCs擁有2種失活特性，快失活和慢失活。神經(jīng)元短時間(數(shù)毫秒)去極化過程中鈉電流的快速衰減即為快失活，而慢失活發(fā)生在細(xì)胞膜長時間(數(shù)秒或數(shù)分鐘)去極化后?？焓Щ畋ＷC了動作電位的短暫性以及不應(yīng)期的產(chǎn)生，本研究發(fā)現(xiàn)M337V突變TDP-43主要抑制了運(yùn)動神經(jīng)元VGSCs快失活功能，而人野生型TDP-43主要改變慢失活的程度，這似乎也提示這兩種蛋白在ALS致病通路中起不同的作用，但最終均導(dǎo)致選擇性運(yùn)動神經(jīng)元變性。

綜上所述，M337V突變TDP-43抑制運(yùn)動神經(jīng)元樣細(xì)胞VGSCs快速失活和激活后恢復(fù)能力，人野生型TDP-43加快了VGSCs激活和慢失活恢復(fù)的特性，提示這兩種TDP-43通過不同的機(jī)制導(dǎo)致和參與ALS的病理生理過程。

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2014-05-15；

2014-07-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81171210)；河北省衛(wèi)生廳指導(dǎo)性課題(20110327)

董惠(1978-)，女，河北唐山人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事神經(jīng)內(nèi)科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：xldoc@126.com

R338.1

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1007-3205(2014)07-0801-05