朱希旺，杜以軍，李 俊，陳 智，于 江，張玉玉，夏焱春，周明明，王金寶*，吳家強(qiáng),3*

(1.山東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,山東 濟(jì)南 250100)

科學(xué)研究

豬IL-10 SYBR Green I Real-time PCR檢測(cè)方法的建立

朱希旺1,2，杜以軍2,3，李 俊2,3，陳 智2,3，于 江2，張玉玉2,3，夏焱春1,2，周明明1,2，王金寶1,2*，吳家強(qiáng)1,2,3*

(1.山東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,山東 濟(jì)南 250100)

白介素-10(IL-10)是一種具有免疫抑制作用的多能細(xì)胞因子。能夠引發(fā)豬免疫抑制效應(yīng)的多種病毒在感染宿主時(shí)均伴隨有明顯的IL-10上調(diào)，其中就包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，然而并不是所有的PRRSV毒株都能上調(diào)IL-10。為了詳細(xì)探討PRRSV免疫抑制與IL-10上調(diào)之間的關(guān)系以及PRRSV感染上調(diào)IL-10的具體分子機(jī)制，本研究針對(duì)豬IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，構(gòu)建了各自含有IL-10、β-actin引物擴(kuò)增序列的重組質(zhì)粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，建立了以2-△△Ct為基礎(chǔ)的SYBR GreenⅠreal-time PCR檢測(cè)方法。該方法線性關(guān)系良好；敏感性高，兩種基因的檢測(cè)下限均為1×101copies/μL；特異性強(qiáng)，擴(kuò)增產(chǎn)物形成單一的特異性熔解峰；重復(fù)性良好，批內(nèi)變異系數(shù)小于2%，批間變異系數(shù)小于3%；目的基因及內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率較高，分別為92.7%、97.8%。綜上所述，該方法可以用于豬IL-10 mRNA水平的表達(dá)分析。

豬；白介素-10；PRRSV；免疫抑制；Real-time PCR

白細(xì)胞介素-10(IL-10)是一種具有多種免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，其最突出的特點(diǎn)是具有炎癥抑制作用[1]。多種細(xì)胞都可以產(chǎn)生IL-10，像單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T/B淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、角質(zhì)層細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，但以免疫性細(xì)胞為主。IL-10最初被稱為“細(xì)胞因子合成抑制因子”，因?yàn)樗軌蛞种贫喾N炎癥因子的合成[2]。IL-10也能夠抑制抗原遞呈作用以及細(xì)胞免疫應(yīng)答[3]。隨著對(duì)IL-10研究進(jìn)展的深入，IL-10與多種炎癥性疾病以及免疫性疾病之間的聯(lián)系正逐漸被建立起來[4]。

許多病毒能夠引發(fā)豬的持續(xù)感染并擁有較高的致病性，主要是因?yàn)檫@些病毒能夠?qū)λ拗髟斐蓢?yán)重的免疫抑制以及免疫損傷。有趣的是，這些病毒的感染往往都伴隨有高水平的IL-10上調(diào)，如口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus ，F(xiàn)MDV)[5]、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)[6]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)[7]等。PRRSV自從20世紀(jì)80年代末出現(xiàn)至今已經(jīng)對(duì)世界各地的畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前有關(guān)PRRSV感染上調(diào)IL-10的機(jī)制研究已見報(bào)道，但其具體分子機(jī)制仍未被完全闡明[8]。然而，并非所有的PRRSV毒株在誘發(fā)豬體免疫抑制的同時(shí)都能夠上調(diào)IL-10[9]。因此，為了進(jìn)一步解析PRRSV感染上調(diào)IL-10的具體分子機(jī)制，深入探討PRRSV免疫抑制與IL-10上調(diào)之間的關(guān)系，需要建立了一種能夠準(zhǔn)確高效檢測(cè)豬IL-10 表達(dá)變化的方法。

目前，檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)量的方法主要集中在蛋白質(zhì)水平和mRNA水平。蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)方法需要依賴特異性的抗體和一定量的目的蛋白，所需時(shí)間較長、成本較高；而real-time PCR在mRNA水平檢測(cè)中憑借其敏感、特異、污染少、可定量、高通量等特點(diǎn)而備受青睞[10-11]。相對(duì)定量real-time PCR方法引入了內(nèi)參基因，能夠減少因操作不當(dāng)?shù)葞淼姆窍到y(tǒng)試驗(yàn)誤差，從而保證了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性、可靠性。本研究通過反復(fù)優(yōu)化反應(yīng)體系與反應(yīng)條件最終建立了以β-actin為內(nèi)參檢測(cè)豬IL-10的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法，為定量檢測(cè)IL-10的mRNA表達(dá)水平，從分子水平深入研究PRRSV免疫機(jī)制提供了有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種及細(xì)胞

大腸桿菌DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，豬外周血單核細(xì)胞(PBMC)分離自4周齡健康仔豬(PRRSV、PCV2抗原、抗體檢測(cè)陰性)。

1.2 主要試劑和儀器

TRIzol Reagent購自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生物工程有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000、凝膠回收試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNase Plus)試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司。PTC-2000型PCR儀購自美國MJResearch公司；核酸定量儀購自購自美國Thermo公司；LightCycler?480購自美國羅氏公司；冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司。

1.3 IL-10及β-actin熒光定量引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genbank中豬IL-10、β-actin的基因序列，選擇保守區(qū)使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，經(jīng)NCBI的BLAST分析證實(shí)引物特異性后交由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。熒光定量PCR引物信息見表1。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 List of primers for real-time PCR

1.4 RNA提取及cDNA的合成

按照TRIzol(Invitrogen)說明書，提取PBMC細(xì)胞總RNA，并測(cè)定其濃度。根據(jù)RNA濃度調(diào)整RNA的用量(≤1 μg)，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)進(jìn)行基因組DNA的去除(10 μL體系)并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(20 μL體系)，以Random 6 mers和 Oligo dT Primer 混合的 RT Primer Mix作為反轉(zhuǎn)錄引物，37 ℃ 15min反轉(zhuǎn)錄，85 ℃ 5 s滅活后置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.5.1 目的片段的擴(kuò)增 使用豬IL-10、β-actin的特異性引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因片段。選用50 μL反應(yīng)體系：10×Buffer 5.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 4.0 μL，上下游引物(10 μmol/ L)各1.0 μL，cDNA模板2 μL，Taq DNA聚合酶(5 u/μL) 1.0 μL，ddH2O 36.0 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后,以1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5.2 目的片段的克隆與鑒定 用膠回收試劑盒回收目的基因DNA，然后將目的片段與pMD 19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板后于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，12 h后挑取單菌落進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定，并將PCR陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 將測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒用核酸定量儀測(cè)定其濃度(OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.0之間)，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。調(diào)整拷貝數(shù)后進(jìn)行倍比稀釋，分別以1011-100copies/μL的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 Real-time PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

Real-time PCR反應(yīng)按照TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNase Plus)試劑盒進(jìn)行。通過比較Cp值、熒光強(qiáng)度、熔解曲線以及是否有引物二聚體峰來確定最佳引物濃度、退火溫度、模板用量等，以得到最佳的熒光定量PCR反應(yīng)條件。

1.7 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別選取5個(gè)連續(xù)梯度(107～103copies/μL)的標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：每個(gè)梯度進(jìn)行三個(gè)樣品重復(fù)，建立20 μL反應(yīng)體系，根據(jù)優(yōu)化的反應(yīng)條件經(jīng)熒光定量PCR儀檢測(cè)后得出Cp值，并由儀器自動(dòng)得出標(biāo)準(zhǔn)曲線、斜率以及擴(kuò)增效率。

1.8 Real-time PCR敏感性試驗(yàn)

以稀釋好的1×100-1×107copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，根據(jù)各稀釋度Cp值比較得出相應(yīng)的檢測(cè)下限。

1.9 Real-time PCR特異性試驗(yàn)

將real-time PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線以及瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.10 Real-time PCR重復(fù)性試驗(yàn)

每個(gè)基因選取107、105、103三個(gè)梯度，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)時(shí)，每個(gè)稀釋度重復(fù)10個(gè)孔；進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)時(shí)，每個(gè)梯度重復(fù)三批，每批四個(gè)重復(fù)。將每個(gè)梯度的Cp值進(jìn)行變異系數(shù)計(jì)算，從而確定該方法的批內(nèi)與批間重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以PBMC的cDNA產(chǎn)物為模板，分別以特異性引物PCR擴(kuò)增豬IL-10、β-actin基因，得到與目的片段大小一致的產(chǎn)物(圖1)。產(chǎn)物回收后與pMD 19-T Vector連接，將PCR陽性質(zhì)粒測(cè)序后與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行一致性比對(duì)，結(jié)果核苷酸同源性均達(dá)到100%。純化后的陽性質(zhì)粒OD260 nm/OD280 nm均介于1.8～2.0之間。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products β-actin of and IL-10M.DL 2000 Marker；1.β-actin；2.IL-10

2.2 Real-time PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

優(yōu)化后的IL-10 20 μL反應(yīng)體系為： 2×SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNase Plus)10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、模板2 μL、RNasefree水7.2 μL。β-actin 20 μL反應(yīng)體系中上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，RNasefree水7 μL，其余成分相同。Real-time PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。

2.3 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以選取的五個(gè)梯度質(zhì)粒(107～103copies/μL)為模板進(jìn)行real-time PCR，得到豬IL-10、β-actin的擴(kuò)增曲線(圖2)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)以及熔解曲線(圖4)。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出,標(biāo)準(zhǔn)品起始模板濃度與Cp值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，并且目的基因、內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率均符合2-△△Ct相對(duì)定量方法的基本要求。

2.4 Real-time PCR敏感性試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-10、β-actin的檢出下限均為1×101copies/μL。 這說明該方法具有良好的敏感性，可以用于分析細(xì)胞因子的表達(dá)差異。

圖2 SYBR GreenⅠreal-time PCR擴(kuò)增曲線 Fig.2 Amplification curves of SYBR Green-Ⅰ real-time PCR

圖3 SYBR GreenⅠreal-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.3 Standard curves of SYBR Green-Ⅰ real-time PCR

圖4 SYBR GreenⅠreal-time PCR融解曲線 Fig.4 Melting curves of SYBR Green-Ⅰ real-time PCR

2.5 Real-time PCR特異性分析

由圖4知，IL-10、β-actin都只有特異性的單峰，并沒有雜峰形成。熒光定量PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳也只有單一的條帶(結(jié)果未顯示)。

2.6 Rea-time PCR重復(fù)性試驗(yàn)

結(jié)果如表2所示，IL-10與β-actin三個(gè)濃度梯度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的Cp值批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù)均低于3%，其中IL-10的批內(nèi)重復(fù)性較好。

表2 SYBR GreenⅠreal-time PCR重復(fù)性分析Table 2 Repeatability analysis of SYBR green I real-time PCR

3 討 論

PRRSV至今仍未得到有效的防控，其根本原因在于病毒能夠嚴(yán)重干擾宿主的免疫系統(tǒng)，使豬容易發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染。病毒感染豬體后使其出現(xiàn)免疫抑制，不僅導(dǎo)致先天免疫應(yīng)答不足、中和抗體水平應(yīng)答遲緩，而且能夠干擾其它疫苗的免疫效果，造成豬瘟等疫苗免疫失敗[12-13]。分析其原因，白介素-10(IL-10)可能在PRRSV的免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起重要作用。IL-10可以抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞合成和產(chǎn)生IL-2、IL-6、IFN-γ及TNF-α等細(xì)胞因子，因此IL-10被普遍認(rèn)為是一種免疫抑制因子。當(dāng)感染了歐洲型或美洲型的PRRSV毒株之后，在感染豬的外周血液單核細(xì)胞(PBMCs)中IL-10的mRNA水平會(huì)增加，并且在氣管肺泡灌洗液(BAL)中的IL-10的濃度也會(huì)增加[14]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有的PRRSV毒株都能夠上調(diào)IL-10。那么，IL-10的免疫抑制作用與PRRSV感染誘導(dǎo)的宿主免疫抑制之間究竟有沒有聯(lián)系？此外，PRRSV感染豬體后經(jīng)哪些信號(hào)通路上調(diào)IL-10？IL-10又通過哪些信號(hào)通路調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答？這些問題都有待于逐步解決。

本試驗(yàn)針對(duì)豬IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，構(gòu)建了各自含有IL-10、β-actin引物擴(kuò)增序列的重組質(zhì)粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，通過反復(fù)優(yōu)化反應(yīng)條件與反應(yīng)體系最終建立了豬IL-10 SYBR GreenⅠreal-time PCR檢測(cè)方法。該方法線性關(guān)系良好，特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性好，目的基因與參照基因的擴(kuò)增效率符合2-△△Ct定量方法的基本要求，可以用于IL-10 在mRNA水平上的表達(dá)差異分析，從而為解析PRRSV免疫抑制與IL-10上調(diào)之間的關(guān)系,闡明病毒上調(diào)IL-10的具體分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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EstablishmentofSYBRGreenI-basedRealativeQuantativeReal-timePCRforPorcineIL-10Detection

ZHU Xi-wang1,2,DU Yi-jun2,3,LI Jun2,3,CHEN Zhi2,3,YU Jiang2,ZHANG Yu-yu2,3XIA Yan-chun1,2,ZHOU Ming-ming1,2,WANG Jin-bao1,2*,WU Jia-qiang1,2,3*

(1.SchoolofLifeSciences,ShandongUniversity,Jinan,Shandong250100,China;2.ShandongKeyLaboratoryofAnimalDiseaseControlandBreeding,Jinan,Shandong250100,China;3.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan,Shandong250100,China)

Interleukin-10(IL-10) is a pluripotential cytokine with immunosuppressive properties.Several virus infections which can cause immunosuppression of swine come along with prominent upregulation of IL-10,among which is the porcine reproductive and respiratory syndrom virus(PRRSV).In spite of this,not all PRRSV strains induce IL-10.In order to figure out the potential molecular mechanism of PRRSV infection on upregulation of IL-10 and the interaction between PRRSV immunosuppression and IL-10-upregulation,two pairs of real-time PCR primers for the amplification of porcine IL-10 and β-actin were designed,standard plasmid recombinants carrying the sequence of these two genes respectively was constructed,and a SYBR GreenI-based 2-△△Ctreal-time PCR detection system was finally established.The results showed that this system displayed good linear relationship,high sensitivity with a detection limit of 1.0×101copies/μL,strong specificity and good repeatability.The real-time PCR products showed single mellting peak,and the coefficient of variation for intra-and inter-assay was less than 3 percent.More important,the PCR efficiencies of IL-10 and β-actin were both close to 100%(92.7%、97.8%respectively).In conclusion,this method can be applied in the mRNA analysis of IL-10 expression.

porcine; IL-10; PRRSV; immunosuppression; real-time PCR

2014-03-12，

2014-04-16

國家自然科學(xué)基金(31340047、31370189);山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(SDAIT-06-011-07)

朱希旺(1990-)，男，山東高唐人，在讀碩士，主要從事動(dòng)物疫病分子免疫學(xué)研究。E-mail:zhuxiwang.good@163.com

*[通訊作者]王金寶(1962-)，男，山東昌邑人，博士，教授，主要從事動(dòng)物疫病分子免疫學(xué)研究。E-mail:jinbaowang@aliyun.com; 吳家強(qiáng)(1975-)，男，山東諸城人，博士，研究員，主要從事動(dòng)物疫病分子免疫學(xué)研究。E-mail:wujiaqiang2000@sina.com

S811.6

A

1005-5228(2014)08-0013-05