劉 里，成飛翔

(曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖 655011)

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光譜法研究頭孢替唑鈉與牛血清白蛋白相互作用

劉 里，成飛翔

(曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖 655011)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，運(yùn)用熒光光譜和紫外-可見光譜法研究了頭孢替唑鈉(CS)與牛血清白蛋白(BSA)之間的相互作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：CS與BSA形成基態(tài)復(fù)合物從而猝滅BSA 的內(nèi)源性熒光，猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅.通過(guò)計(jì)算獲得了二者在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù).通過(guò)計(jì)算反應(yīng)熱力學(xué)參數(shù)值，可推斷CS與BSA 作用力主要為靜電引力，生成自由能變?chǔ)為負(fù)值，表明CS與BSA的作用過(guò)程是一個(gè)自發(fā)過(guò)程.兩者的結(jié)合部位主要位于亞螺旋域ⅡA中.Hill系數(shù)nH大于1，表明CE有正協(xié)同作用.同步熒光光譜表明CS對(duì)BSA構(gòu)象不產(chǎn)生影響，結(jié)合位點(diǎn)更接近于酪氨酸.

頭孢替唑鈉；熒光猝滅；相互作用

0 引言

血清白蛋白是一類重要的運(yùn)輸性蛋白，在生物體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)中含量非常豐富，幾乎占血清蛋白的60%[1-3].近年來(lái)采用光譜研究藥物與血清白蛋白的相互作用已成為生命科學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，這對(duì)于了解生命過(guò)程、藥物作用機(jī)制及藥物分子設(shè)計(jì)等都具有重要作用[4-5].因結(jié)構(gòu)上和人血清白蛋白的相似性，牛血清白蛋白(簡(jiǎn)稱BSA)[6]被廣泛地運(yùn)用于與藥物結(jié)合作用的研究.頭孢替唑鈉(Ceftezole Sodium，簡(jiǎn)稱CS)是治療敗血癥、肺炎、支氣管炎、肺膿癥、腹膜炎、腎盂腎炎、膀胱炎等的常用藥[7].因此，研究CS與BSA的相互作用對(duì)理解藥物的作用機(jī)制具有重要意義.以往研究藥物與BSA相互作用主要集中在猝滅機(jī)理探討上，而本文在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的情況下從更多角度研究了CS與BSA的結(jié)合反應(yīng)，除了常規(guī)的作用機(jī)理的研究，還深入探討了不同溫度下兩者的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合力類型、結(jié)合部位、藥物之間的協(xié)同性以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響等.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

F-4600熒光光譜儀(日本日立公司)，狹縫寬度10.0 nm，光電倍增管負(fù)電壓為-400 V；Cary50型紫外-可見光譜儀(美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司);pHS-3C精密酸度計(jì)(上海虹益儀器儀表有限公司);DHG-9035A型超級(jí)恒溫水浴(上海一恒科技有限公司).

牛血清白蛋白(BSA，上海楷樣生物技術(shù)有限公司)，頭孢替唑鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%， 上海研生實(shí)業(yè)有限公司)，其它試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

1.2 試驗(yàn)方法

在10.0 mL比色管中依次加入1.0×10-5mol·L-1的BSA溶液0.75 mL、1.0×10-4mol·L-1的不同體積的頭孢替唑鈉溶液、0.5 mol·L-1NaCl溶液2.0 mL(保持體系的離子強(qiáng)度)和pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液2 mL，用水釋至刻度并搖勻.放置 60 min后，分別在287、301、311 K溫度下，測(cè)定熒光光譜，記錄CS不存在與存在時(shí)體系的熒光強(qiáng)度F0和F.其最大激發(fā)波長(zhǎng)(λex)和最大發(fā)射波長(zhǎng)(λem)分別位于280 nm和332 nm 處.掃描Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時(shí)體系的同步螢光光譜，以不含CS和BSA的溶液作為參比，記錄CS-BSA體系的吸收光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 緩沖溶液類型、pH值及用量的優(yōu)化 考察濃度為0.01 mol·L-1，pH值為7.40的K2HPO4-KH2PO4、K2HPO4-檸檬酸、Tris-HCl、硼酸-硼砂及KH2PO4-NaOH緩沖溶液對(duì)反應(yīng)體系的影響.結(jié)果表明，緩沖溶液對(duì)體系影響不大，使用Tris-HCl時(shí)效果最好(見圖1).

在Tris-HCl緩沖范圍(pH值為7.10～8.90)內(nèi)，分別考察了pH值和緩沖溶液用量對(duì)體系的影響，結(jié)果見圖2.結(jié)果表明：當(dāng)pH值為7.35～8.50時(shí)(圖2(A))，緩沖溶液用量在1.5～2.0 mL范圍內(nèi)(圖2(B))，體系的F0/F達(dá)到最大且保持穩(wěn)定，因人體正常生理pH值范圍為7.35～7.45，所以實(shí)驗(yàn)選擇pH值為7.40的Tris-HCl溶液2.0 mL作為緩沖溶液.

1.K2HPO4-KH2PO4;2.硼酸-硼砂;3.KH2PO4-檸檬酸;4.KH2PO4-NaOH;5.Tris-HCl. c(BSA)= 1.0×10-6 mol·L-1,c(CS)=2.0×10-5 mol/L.

c(BSA)= 1.0×10-6 mol·L-1,c(CS)=2.0×10-5 mol·L-1.

2.1.2 BSA濃度的優(yōu)化 考察BSA濃度在1.0×10-7～1.5×10-6mol·L-1范圍內(nèi)對(duì)體系的熒光強(qiáng)度的影響(見圖3).實(shí)驗(yàn)表明：BSA濃度在5×10-7～1.5×10-6mol·L-1范圍內(nèi)時(shí)，F(xiàn)0/F基本保持穩(wěn)定且最大.因此實(shí)驗(yàn)選用7.5×10-7mol·L-1作為反應(yīng)濃度.

c(CS)=2.0×10-5 mol·L-1.

2.1.3 試劑加入順序的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)分別研究了4種加入順序，結(jié)果表明試劑加入順序?qū)w系的影響不大，實(shí)驗(yàn)選擇BSA→CS→NaCl→Tris-HCl的加入順序.

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 在以上優(yōu)化條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系的影響，結(jié)果見圖4.結(jié)果表明，CS與BSA需要60 min左右完成，4 h內(nèi)基本穩(wěn)定，故以下溶液配制后放置60 min后進(jìn)行熒光測(cè)量.

圖4 反應(yīng)時(shí)間的影響

2.2 熒光猝滅光譜

在實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件下，考察CS對(duì)BSA熒光光譜的影響，結(jié)果見圖5.CS在測(cè)量波段沒有熒光，而BSA的熒光較強(qiáng)，并在λex/λem=280/340 nm處，當(dāng)CS加入到BSA之后，雖然λex/λem幾乎未發(fā)生變化，但是其熒光強(qiáng)度明顯隨著CS濃度的增加而逐漸減弱，表明CS能猝滅BSA的熒光，CS與BSA之間存在著相互作用.

1→13.c(BSA)=7.5×10-7 mol·L-1,c(CS)=(0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5) ×10-5 mol·L-1.

2.3 猝滅類型的判斷

引起熒光猝滅的原因很多，但通常分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅[8-12].常用溫度的改變而引起體系的變化來(lái)確定猝滅類型.在動(dòng)態(tài)猝滅中分子擴(kuò)散起主導(dǎo)，猝滅常數(shù)會(huì)隨著溫度的升高而增大；對(duì)于靜態(tài)猝滅，因有新物質(zhì)生成，穩(wěn)定性起主導(dǎo)作用，溫度越高，猝滅常數(shù)反而越小.猝滅過(guò)程遵循S-V方程：F0/F=1+KSV[C]=1+Kqτ0[C] ，其中KSV為猝滅常數(shù)；Kq為速率常數(shù)(動(dòng)態(tài)猝滅時(shí)最大值約為2×1010L·mol-1·s-1)；τ0為熒光體平均壽命，一般為10-8s數(shù)量級(jí)；[C]為CS濃度.按照實(shí)驗(yàn)方法在287 K、301 K和311 K時(shí)以F0/F對(duì)[C]作圖(見圖6).根據(jù)Kq=Ksv/τ0可求出不同溫度下的Kq值，結(jié)果列于表1中.表1所有溫度下的Kq值比動(dòng)態(tài)猝滅最大速率常數(shù)大2個(gè)數(shù)量級(jí)， 說(shuō)明CS對(duì)BSA的猝滅不屬于動(dòng)態(tài)猝滅.由圖6可知，3個(gè)溫度下的Stern-Volmer曲線均呈良好的線性關(guān)系，且隨著溫度的升高，直線斜率即Ksv減小，正好與靜態(tài)猝滅機(jī)理相吻合.

圖7 3個(gè)不同溫度下的S-V圖

表1 S-V 線性回歸方程的相關(guān)參數(shù)

若CS對(duì)BSA為靜態(tài)猝滅，應(yīng)符合L-B方程[13-15]： (F0-F)-1=F-10+(KLBF0[C])-1，其中KLB為靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù).(F0-F)-1-[C]-1作不同溫度下的L-B曲線，結(jié)果見圖7.由圖7可知，隨著溫度的升高，斜率逐漸增大，則KLB逐漸下降，這與因靜態(tài)猝滅方式而形成的復(fù)合物隨溫度升高而越不穩(wěn)定的作用機(jī)理相符.計(jì)算KLB值列于表2中，表2中3個(gè)溫度下的KLB值都在103數(shù)量級(jí)以上，表明CS與BSA由于發(fā)生靜態(tài)猝滅而結(jié)合力較強(qiáng).

圖7 不同溫度下BSA-CS的L-B曲線

表2 L-B 線性回歸方程的相關(guān)參數(shù)

紫外吸收光譜也是一種區(qū)分猝滅機(jī)理的重要方法，固定BSA濃度不變，改變CE的濃度，以相應(yīng)濃度的CS為參比，在紫外-可見光譜儀上對(duì)體系進(jìn)行紫外光譜掃描，可得到CS與BSA 結(jié)合后的紫外吸收光譜圖，如圖8所示.實(shí)驗(yàn)表明，CS的加入使BSA中苯環(huán)上的π-π*躍遷引起的特征吸收峰從276 nm藍(lán)移到264 nm，吸收強(qiáng)度也隨CS濃度的加大而明顯增加.CS的加入引起B(yǎng)SA紫外吸收光譜的變化這一現(xiàn)象，說(shuō)明CS與BSA間發(fā)生了反應(yīng)，有新物質(zhì)生成，更進(jìn)一步證明兩者之間的相互作用機(jī)理屬于靜態(tài)猝滅機(jī)理.

c(BSA)= 7.5×10-6 mol·L-1,c(CS)=(0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3,5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5) ×10-5 mol·L-1.

2.4 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

如藥物小分子與BSA大分子存在n個(gè)等同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，它們相互作用的關(guān)系符合lg[(F0-F)/F]= lgKb+nlg[C]公式[13-15].分別在287 K、301 K、311 K溫度下，以lg(F0-F)/F對(duì)lg[C]作圖，由直線的斜率和截距可求出CS與BSA不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Kb及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果見表3.由表3可知，3個(gè)溫度下的n都約等于1，表明CS與BSA結(jié)合后可形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn).隨著溫度增加，Kb和n值減少的程度不大，表明CS與BSA的相互作用對(duì)溫度變化不是很敏感.總之，溫度的提升不利于血清白蛋白攜帶著CS在體內(nèi)進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)、貯存和分配.

表3 CS-BSA的Kb和n

2.5 熱力學(xué)常數(shù)及結(jié)合力類型

靜電引力、疏水作用力、氫鍵和范德華力等是藥物小分子與蛋白質(zhì)大分子的主要結(jié)合作用力.把結(jié)合反應(yīng)的焓變?chǔ)看作是一個(gè)常數(shù)(溫度變化范圍不大時(shí))[13-17]，根據(jù)熱力學(xué)公式計(jì)算287 K、301 K和311 K溫度下CS與BSA結(jié)合反應(yīng)的ΔH、熵變?chǔ)及吉布斯自由能變?chǔ)， 結(jié)果見表4.根據(jù)P.D.Ross等總結(jié)出的的規(guī)則判斷，由表4可得，ΔG<0表明BSA與CS的反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行；ΔH<0，表明反應(yīng)為放熱反應(yīng)；ΔS>0，表明其過(guò)程是熵增加的自發(fā)過(guò)程；ΔH<0且ΔS>0，表明靜電作用力是CS與BSA的主要結(jié)合作用力.

表4 不同溫度下CS與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.6 結(jié)合位置的確定

與人血清白蛋白相似，BSA含有3個(gè)α-螺旋域(Ⅰ～Ⅲ) ，每個(gè)α-螺旋域包含2個(gè)亞螺旋域 A 和 B.為確定藥物小分子與BSA具體結(jié)合的位置，考察在兩者的作用過(guò)程中色氨酸和酪氨酸殘基的實(shí)際參與情況，應(yīng)用A.Sulkowska等[18-20]提出的方法，即比較波長(zhǎng)在280 nm 和 295 nm 激發(fā)時(shí)CS-BSA體系熒光程度的降低變化.由圖9可知，在波長(zhǎng)在280 nm和295 nm激發(fā)下，CS對(duì)BSA的猝滅程度曲線沒有重疊，說(shuō)明色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中，對(duì)比這2種波長(zhǎng)下的熒光猝滅程度可知，在280 nm激發(fā)時(shí)降低程度更大些，這一現(xiàn)象說(shuō)明在CS與BSA的結(jié)合過(guò)程中，結(jié)合位點(diǎn)主要位于亞螺旋域ⅡA.

2.7 藥物協(xié)同性

BSA具有多重結(jié)合部位，藥物與BSA結(jié)合時(shí)，BSA各結(jié)合部位之間存在相互影響作用，這種相互影響作用稱為藥物的協(xié)同作用，可用Hill方程[18-20]進(jìn)行分析：lgD/(1-D)=lgKH+nHlg[C]，其中H為結(jié)合飽和分?jǐn)?shù)，KH為結(jié)合常數(shù)，nH為Hill系數(shù).在熒光實(shí)驗(yàn)中：D/(1-D)=B/(Bm-B)，其中B=(F0-F)/F0；1/Bm是1/B對(duì)1/[C]作圖的截距.CS-BSA的nH值的計(jì)算結(jié)果見表5.由表5可知，3個(gè)溫度下的nH都大于1，表現(xiàn)為正協(xié)同作用，說(shuō)明CS與BSA結(jié)合過(guò)程中，隨著配體CS不斷地結(jié)合到位點(diǎn)，使得后繼配體對(duì)BSA的親和性增加，即前一個(gè)藥物分子結(jié)合到BSA位點(diǎn)上后，對(duì)后一個(gè)藥物分子與BSA的結(jié)合起到促進(jìn)作用.隨著溫度的變化，雖然nH變化不大，但也隨溫度升高而降低，說(shuō)明溫度的提升對(duì)CS藥物小分子之間的協(xié)同作用不利.

圖9 λex為 280 nm 和 295 nm 時(shí)，CS-BSA的熒光猝滅曲線

表5 不同溫度下的nH值

2.8 CS對(duì)BSA構(gòu)象的影響

蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化通常用同步熒光光譜來(lái)分析，根據(jù)λem的變化來(lái)確定其熒光猝滅主要由何種氨基酸殘基起主導(dǎo)作用，而且氨基酸殘基的λem移動(dòng)方向與其所處的疏水性也緊密相關(guān).Δλ=60 nm和Δλ=15 nm分別顯示色氨酸和酪氨酸殘基的熒光特征.在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm條件下測(cè)CS加入BSA之后的同步熒光光譜見圖10.由圖10可知，隨CS濃度的增大，這2種氨基酸殘基的λem幾乎沒有發(fā)生移動(dòng)，說(shuō)明CS的加入不改變BSA的構(gòu)象.酪氨酸的猝滅程度大于色氨酸，表明CS與BSA相結(jié)合的位點(diǎn)偏向于酪氨酸.

c(BSA)= 7.5×10-6 mol·L-1,c(CS)=(0、1、1.5、2、2.5、3、3,5、4、4.5、5、5.5、6、6.5) ×10-5 mol·L-1.

3 結(jié)論

用熒光和紫外光譜法推斷CS對(duì)BSA熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅，CS和BSA之間的作用力類型主要為靜電作用力.測(cè)得287 K、301 K和311 K的Kb、n和nH.CS與BSA可形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，表明CS可被BSA運(yùn)輸.nH>1，表明CS對(duì)結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生正協(xié)同作用，即CS加入使BSA的親和性增強(qiáng)，有利于后續(xù)CS與BSA的結(jié)合.結(jié)合部位在BSA的亞螺旋域ⅡA中.同步熒光光譜表明CS幾乎不對(duì)BSA構(gòu)象產(chǎn)生影響，結(jié)合位點(diǎn)靠近酪氨酸殘基.該研究結(jié)果為了解CS在體內(nèi)的運(yùn)輸和代謝過(guò)程、毒性機(jī)制提供了重要信息.

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(責(zé)任編輯：劉顯亮)

TheStudyonInteractionbetweenCeftezoleSodiumandBovineSerumAlbuminbySpectrometry

LIU Li,CHENG Fei-xiang
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Qujing Normal University，Qujing Yunnan 655011，China)

Under the optimal conditions，the interaction of ceftezole sodium (CS) with bovine serum albumin(BSA) was investigated by fluorescence spectrometry and ultraviolet-visible light absorption spectrometry.The experiments demonstrated that the CS quenched the intrinsic fluorescence of BSA by forming CS-BSA complex.The mechanism of the fluorescence quench was static quenching.The binding constants and the numbers of binding site at different temperatures were calculated.The main binding forces were concluded as electrostatic forces from the calculated values of the thermodynamic parameter.The process of binding was spontaneous because that Gibbs free energy change was negative.The primary binding site for CS was located at sub-domain ⅡA of BSA.The values of Hill's coefficients were more than 1,which indicated that there was some positive cooperative effect.The effect of CS on the conformation of BSA was also studied by using synchronous fluorescence spectroscopy.Studies utilizing synchronous spectra showed that the conjugation reaction between CS and BSA would not affect the conformation of BSA.Synchronous fluorescence indicated that the binding site of CS and BSA was near by tyrosine residue.

ceftezole sodium;fluorescence quenching;interaction

2014-10-03

國(guó)家自然科學(xué)基金(21261019)資助項(xiàng)目.

劉 里(1982-)，女，滿族，吉林省吉林市人，講師，主要從事藥物化學(xué)和分子發(fā)光學(xué)理論與應(yīng)用研究.

1000-5862(2014)06-0639-06

O 657.3

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