雷鳴 許開亮 趙龍姝 姚玉龍 陳秀妹

(上海市第七人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200137)

細(xì)菌內(nèi)毒素及其誘導(dǎo)生成的大量炎性細(xì)胞因子是感染性休克時持續(xù)低血壓的重要原因之一。這些炎性細(xì)胞因子中，以對腫瘤壞死因子α(TNF-α)研究居多[1]，與之作用相似的另一細(xì)胞因子——鈣結(jié)合蛋白S100A8近來逐漸受到關(guān)注。S100A8 是S100 蛋白家族成員，又稱MRP8 (migration inhibitory factor related protein-8)。S100A8是一個多功能分子，可參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖，并在髓系細(xì)胞分化以及動物的胚胎發(fā)育和免疫炎性反應(yīng)過程中起重要作用。行使功能時，S100A8通常與S100蛋白家族的另一個成員S100A9(MRP14)形成異二聚體，介導(dǎo)完成生物學(xué)功能[2]。越來越多的研究[3-4]表明，在機(jī)體受到強(qiáng)烈刺激或在應(yīng)激狀態(tài)下，膽堿能抗炎通路被激活，通過神經(jīng)及其遞質(zhì)乙酰膽堿的相互作用，對抗炎性反應(yīng)因子，降低生物毒素的致死率，調(diào)節(jié)或?qū)谷硌仔苑磻?yīng)，提示膽堿能抗炎通路對感染性休克導(dǎo)致的過度全身性炎性反應(yīng)有一定的預(yù)防和拮抗作用。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔法(cecal ligation and puncture，CLP)制作大鼠感染性休克模型，進(jìn)而檢測電刺激感染性休克大鼠的迷走神經(jīng)時血壓、血漿鈣結(jié)合蛋白S100A8含量的變化，探究在抗感染性休克中迷走神經(jīng)興奮所起的作用與相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)所用動物和分組實(shí)驗(yàn) 選取體質(zhì)量250～300 g的健康雄性Wistar大鼠(SPF級)30只，將大鼠隨機(jī)分為6組，每組5只。分組如下：①假電針正常組：假電針刺激迷走神經(jīng)干；②電針正常組：電針刺激迷走神經(jīng)干；③假電針CLP組：行CLP術(shù)+假電針刺激迷走神經(jīng)干；④電針CLP組：行CLP術(shù)+電針刺激迷走神經(jīng)干；⑤迷切假電針CLP組：行CLP術(shù)+雙頸部迷走神經(jīng)干離斷術(shù)+假電針刺激迷走神經(jīng)干；⑥迷切電針CLP組：行CLP術(shù)+雙頸部迷走神經(jīng)干離斷術(shù)+電針刺激迷走神經(jīng)干。

1.2 CLP模型建立 大鼠腹腔注射烏拉坦(濃度為200 g/L，劑量為1 g/kg體質(zhì)量)，麻醉后，行頸總動脈和迷走神經(jīng)的分離手術(shù)；并且對頸總動脈進(jìn)行置管連接，連續(xù)監(jiān)測直接動脈壓。在大鼠前腹正中作一長2～3 cm的切口，切開后，游離腸系膜和盲腸，用3-0絲線環(huán)繞盲腸根部并結(jié)扎，再用9號針頭在盲腸端部行兩處穿刺，兩處穿刺位置相距3 mm左右，穿刺后將盲腸還納回腸管，然后逐層縫合，關(guān)腹。手術(shù)完成后，皮下注射0.9%氯化鈉液(30 mL/kg)，以補(bǔ)充手術(shù)過程中丟失的體液。碘附消毒大鼠，包扎傷口。對假CLP組實(shí)驗(yàn)動物不進(jìn)行結(jié)扎手術(shù)，亦不進(jìn)行盲腸穿刺，其余與CLP組操作一致。

1.3 迷走神經(jīng)離斷和電刺激 麻醉完成后，仰臥位放置大鼠。備皮并進(jìn)行固定，沿頸腹正中線(喉頭與胸骨之間位置)作2.5～4 cm長的切口，用止血鉗分離胸骨甲狀肌和骨舌骨肌，分離后尋找頸動脈鞘(其內(nèi)含有頸動脈和頸部神經(jīng))。實(shí)驗(yàn)操作者用左手拇指和食指抓住大鼠頸皮和頸肌，用中指指尖頂起頸皮和頸肌使其外翻，右手持玻璃分針或蚊式止血鉗沿著血管走向慢慢將迷走神經(jīng)和頸總動脈分離3～4 cm，用4-0絲線結(jié)扎迷走神經(jīng)，然后將其剪斷，在遠(yuǎn)端將其與雙鉑電極連接。CLP術(shù)后立即以5V、2 ms和l Hz強(qiáng)度的電能，持續(xù)刺激迷走神經(jīng)遠(yuǎn)端20 min。

1.4 主要試劑及儀器 大鼠鈣結(jié)合蛋白S100A8 ELISA試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所)，瑞士TECAN公司Infinite 200酶標(biāo)儀，日本光電公司Nihon kohdensEN-7103電生理刺激儀。

1.5 觀察指標(biāo)及樣本采集

1.5.1 大鼠的一般狀況及血流動力學(xué)指標(biāo) CLP術(shù)后觀察動物有無寒顫、豎毛、萎靡、膿尿、眼角分泌物增加及腹瀉等表現(xiàn)。平均動脈壓的檢測由頸總動脈連接管進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。12 h后處死大鼠，解剖并用肉眼觀察不同器官的形態(tài)。

1.5.2 血漿鈣結(jié)合蛋白S100A8含量的測定 分別在電刺激迷走神經(jīng)后6 h和12 h，于頸總動脈處采0.8 mL血，置于含EDTA抗凝劑的無菌離心管中，離心(4℃，3500 g)15 min后，吸取上清，保存于-70℃待用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測血漿鈣結(jié)合蛋白S100A8蛋白水平，按試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠機(jī)體狀況和形態(tài)學(xué)變化 CLP手術(shù)后，大鼠活動度減少，出現(xiàn)嗜睡、豎毛，不飲水或飲水減少，呼吸不正常(有時急促)，并伴有有膿尿、腹瀉和眼睛分泌滲出物等。解剖大鼠發(fā)現(xiàn)，CLP組和迷切組大鼠出現(xiàn)腹腔滲出液伴血，惡臭；盲腸粘連，有壞疽，腫脹變黑；空腸腸管脹氣；肝臟、肺臟、腎臟等器官水腫并充血，產(chǎn)生瘀點(diǎn)甚至瘀斑等。電刺激組上述變化不明顯。

2.2 大鼠平均動脈壓改變 見表1。

表1 各組大鼠平均動脈壓的變化(mmHg)

2.3 血漿鈣結(jié)合蛋白S100A8表達(dá)水平變化 模型建立成功后，采用ELISA法檢測血漿鈣結(jié)合蛋白S100A8，結(jié)果顯示，血漿鈣結(jié)合蛋白S100A8含量顯著升高，相比正常組，各相應(yīng)時間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。切斷迷走神經(jīng)后，血漿鈣結(jié)合蛋白S100A8表達(dá)水平上升更明顯，與CLP組相比，各時間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。迷走神經(jīng)受電刺激后，血漿鈣結(jié)合蛋白S100A8表達(dá)水平顯著降低；在CLP手術(shù)后6 h和12 h均低于迷切假電針CLP組各個時間點(diǎn)的鈣結(jié)合蛋白S100A8表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 不同組大鼠CLP術(shù)后不同時間點(diǎn)血漿S100A8水平的比較(ng/mL)

3 討 論

發(fā)生炎性反應(yīng)時，中性粒細(xì)胞會分泌產(chǎn)生大量炎性因子，包括S100A8。研究[5]表明，S100A8參與了急、慢性炎性反應(yīng)，炎性反應(yīng)病灶周圍存在的大量白細(xì)胞會被S100A8的趨化作用吸引，進(jìn)而產(chǎn)生抗炎效應(yīng)。一方面，促炎物質(zhì)腫瘤壞死因子(TNF) 以及白細(xì)胞介素1(IL-1)、γ- 干擾素(IFN-γ)等均可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)S100A8；另一方面，在特定生理狀態(tài)下，S100A8可直接刺激炎性細(xì)胞分泌炎性反應(yīng)分子，參與拮抗炎性反應(yīng)疾病的過程[6]。另有研究[7]表明，S100A8 作為炎性反應(yīng)標(biāo)志分子，比C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)更可靠。然而，目前對于S100A8在炎性反應(yīng)中與迷走神經(jīng)膽堿能抗炎通路的關(guān)系的研究極少。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠接受CLP術(shù)后，平均動脈壓進(jìn)行性下降，血漿中S100A8顯著升高；而電刺激迷走神經(jīng)后，平均動脈壓下降趨勢減緩，血漿中S100A8水平顯著降低，表明電刺激迷走神經(jīng)可減輕全身性炎性反應(yīng)；其機(jī)制可能是迷走神經(jīng)興奮后釋放大量乙酰膽堿；后者與存在于多形核白細(xì)胞上的乙酰膽堿受體結(jié)合，通過一系列途徑抑制白細(xì)胞釋放S100A8，從而拮抗炎性反應(yīng)。

目前，臨床試驗(yàn)中用于治療感染性休克的炎性反應(yīng)因子的抗體和炎性反應(yīng)介質(zhì)的拮抗劑等抗炎效果均不理想[7]。最近研究[8]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病菌侵襲機(jī)體時，迷走神經(jīng)可快速作用于巨噬細(xì)胞，抑制炎性反應(yīng)因子的釋放，而達(dá)到拮抗炎性反應(yīng)、保護(hù)機(jī)體免受損害的目的。因此，迷走神經(jīng)膽堿能抗炎通路，可以在治療感染或炎性反應(yīng)性休克中發(fā)揮重要作用，為臨床治療休克提供新的思路。膽堿能通路在抗炎性反應(yīng)中的作用逐漸被揭示并備受關(guān)注[9]。S100A8 是一種Ca2+結(jié)合蛋白，該蛋白具有促炎性反應(yīng)活性。目前認(rèn)為，S100A8 可以調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，主要通過參與相應(yīng)的信號通路實(shí)現(xiàn)，而關(guān)于S100A8蛋白與膽堿能通路相互作用的研究甚少，這二者是否在抗炎性反應(yīng)中形成一個反饋是一個值得探討的問題[10]。本試驗(yàn)研究結(jié)果提示，在全身性炎性反應(yīng)中，迷走神經(jīng)膽堿能通路會下調(diào)S100A8的表達(dá)，從而起到抗炎性反應(yīng)的作用，S100A8在感染性休克抗炎性反應(yīng)治療中用重要應(yīng)用價值，有望成為炎性反應(yīng)預(yù)測和治療的新選擇。

[1]TeohNC, Farrell GC.Hepatic ischemia reperfusion injury: pathogenic mechanisms and basis for hepatoprotection[J].J Gastroenterol Hepatol.2003, 18(8):891-902.

[2]Donato R, Cannon BR, Sorci G,et al.Functions of S100 Proteins[J]. CurrMol Med, 2013, 13(1):24-57.

[3]Pavlov VA, Wang H, Czura CJ,et al.The cholinergic anti-inflammatory pathway: a missing link in neuroimmunomodulation[J].Mol Med, 2003, 9(5-8):125-134.

[4]Picq CA, Clarencon D, Sinniger VE, et al. Impact of Anesthetics on Immune Functions in a Rat Model of Vagus Nerve Stimulation[J]. PLoS One, 2013, 8(6):e67086.

[5]饒亞嵐, 陳肖華, 王琳, 等. 7Gyγ射線照射后4h小鼠骨髓差異表達(dá)基因的初步研究[J].國際放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)雜志,2007, 31: 245-247

[6]Koy M1, Hambruch N, Hussen J, et al.Recombinant bovine S100A8 and A9 enhance IL-1β secretion of interferon-gamma primed monocytes[J].Vet ImmunolImmunopathol, 2013,155(3):162-170.

[7]Simard JC, Cesaro A, Chapeton-Montes J,et al. S100A8 and S100A9 induce cytokine expression and regulate the NLRP3 inflammasome via ROS-dependent activation of NF-κB(1.)[J].PLoS One, 2013,8(8):e72138.

[8]Martelli D, Yao ST, Mancera J,et al. Reflex control of inflammation by the splanchnic anti-inflammatory pathway is sustained and independent of anesthesia[J].Am J PhysiolRegulIntegr Comp Physiol, 2014, pii: ajpregw.00259.2014 [Epub ahead of print]

[9]胡正芳,李建國,杜朝暉,等. 電刺激迷走神經(jīng)對感染性休克大鼠肝臟炎性反應(yīng)的影響[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2004,25(4):368-372.

[10]Pavlov VA, Wang H, Czura CJ, et al．The cholinergic anti-inflammatory pathway: a missing link in neuroimmunomodulation[J].Mol Med, 2003,9(5-8):125-134.