徐 希 陳衛(wèi)昌 朱一凡 錢夷婷

蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化內科(215006)

基質金屬蛋白酶(MMPs)家族是一組具有降解和重塑細胞外基質(ECM)功能的蛋白酶類，被認為與腫瘤細胞的生長、分化、侵襲、轉移等生物學行為密切相關[1-2]。MMP-9屬于明膠酶類，又名明膠酶B(gelatinase B)，是MMPs家族的重要成員。而中性粒細 胞明膠酶相關載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)是在研究MMP-9時發(fā)現(xiàn)的小分子蛋白，是脂質運載蛋白(lipocalin)家族的新成員，可與MMP-9結合形成復合物，阻止MMP-9降解以維持其酶活性[3]。既往研究顯示MMP-9過表達與多種惡性腫瘤的進展、轉移密切相關[4-5]。本研究采用ELISA方法檢測胃癌患者的血清MMP-9、NGAL水平，旨在初步探討兩者在胃癌患者外周血中的變化及其臨床意義。

對象與方法

一、研究對象

選擇2012年5月-2013年5月在蘇州大學附屬第一醫(yī)院就診的胃癌患者76例，其中男56例，女20例，年齡32～88歲，平均(62.89±9.55)歲。入選患者胃癌診斷經(jīng)胃鏡活檢或手術病理證實，均為初治患者，之前未接受過放化療以及其他抗腫瘤治療，均簽署知情同意書。其中65例患者接受手術治療，臨床和病理資料完整，術后病理均為腺癌，分期采用2010年UICC/AJCC胃癌TNM分期標準。另選取同期健康體檢者50名作為正常對照組，其中男34例，女16例，年齡34～72歲，平均(55.27±12.03)歲，無心、肺、肝、腎等重要臟器疾病，無系統(tǒng)性炎癥性疾病，無全身急慢性感染性疾病，肝腎功能正常。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。胃癌組與正常對照組間性別構成、年齡差異無統(tǒng)計學意義。

二、方法

抽取受試者清晨空腹外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝，室溫靜置1 h，4 360×g離心5 min，小心吸取上層血清，置于干燥潔凈凍存管中，-80 ℃保存待測。MMP-9、NGAL濃度檢測采用ELISA方法，試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司，嚴格按試劑盒說明書進行操作，于酶標儀450 nm波長處讀取吸光度值，繪制標準曲線，計算血清MMP-9、NGAL濃度。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、血清MMP-9、NGAL水平及其與胃癌臨床病理參數(shù)的關系

胃癌組血清MMP-9、NGAL水平均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(表1)。進一步分析65例接受手術治療者的血清MMP-9、NGAL水平與胃癌臨床病理參數(shù)的關系，發(fā)現(xiàn)不同TNM分期胃癌患者間的MMP-9、NGAL水平總體差異有統(tǒng)計學意義，其中Ⅰ+Ⅱ期MMP-9水平顯著低于Ⅲ期和Ⅳ期(P=0.002,P=0.026)，Ⅲ、Ⅳ期間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.852)；Ⅳ期NGAL水平顯著高于Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期(P=0.005,P=0.012)，Ⅰ+Ⅱ期與Ⅲ期間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.495)。此外，有淋巴結轉移者、腫瘤浸潤突破漿膜層者血清MMP-9水平分別顯著高于無淋巴結轉移者和未突破漿膜層者，有遠處轉移者血清NGAL水平顯著高于無遠處轉移者。腫瘤分化程度與血清MMP-9、NGAL水平均無關(表2)。

表1 兩組血清MMP-9、NGAL水平比較

二、相關性分析

相關性分析顯示，胃癌患者的血清MMP-9、NGAL水平均與腫瘤TNM分期呈顯著正相關(P=0.010,rs=0.318;P=0.008,rs=0.328)，血清MMP-9與NGAL水平之間則無顯著相關關系(P=0.235,r=0.138)。

三、血清MMP-9、NGAL篩查胃癌的診斷性能

繪制血清MMP-9、NGAL篩查胃癌的ROC曲線(圖1)，兩者曲線下面積(AUC)分別為0.832和0.942。MMP-9的最佳臨界值為608.19 ng/mL，相應敏感性和特異性分別為64.5%和90.0%；NGAL的最佳臨界值為14.71 ng/mL，相應敏感性和特異性分別為85.5%和90.0%。如采用并聯(lián)試驗，兩者聯(lián)合檢測的敏感性和特異性分別為 94.7%和82.0%。

討 論

胃癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是多種因素共同作用的復雜過程。侵襲和轉移是惡性腫瘤最重要的生物學特征，也是患者死亡的主要原因。腫瘤細胞突破基底膜是腫瘤轉移的關鍵步驟，因此腫瘤細胞必須具備降解ECM的能力， 才能向周圍組織浸潤并侵入血管、 淋巴管向遠處轉移，MMPs家族成員通過介導ECM降解，在此步驟中起至關重要的作用[1-2]。MMP-9由Sopata和Dancewicz于1974年在中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)，其能降解Ⅳ、Ⅴ型膠原和Ⅰ、Ⅴ型明膠，破壞基底膜完整性，在腫瘤侵襲和轉移過程中發(fā)揮重要作用，MMP-9過表達已被證實與乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤的進展、轉移密切相關[4-5]。此外，MMP-9尚可參與腫瘤血管生成，其機制與降解血管基底膜和周圍間質以及血管內皮生長因子(VEGF)的合成和釋放有關[6]。

表2 胃癌患者血清MMP-9、NGAL水平與臨床病理參數(shù)的關系

圖1 血清MMP-9、NGAL篩查胃癌的ROC曲線

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者的血清MMP-9水平顯著高于健康人，其中有淋巴結轉移者顯著高于無淋巴結轉移者，腫瘤浸潤突破漿膜層者顯著高于未突破漿膜層者，晚期胃癌(Ⅲ、Ⅳ期)顯著高于早期胃癌(Ⅰ、Ⅱ期)。Kabashima等[7]發(fā)現(xiàn)癌組織MMP-9表達與黏膜內胃癌的淋巴結轉移和淋巴管彌散顯著相關；Torii等[8]發(fā)現(xiàn)胃癌患者術前血漿MMP-9水平顯著增高并與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和pTNM分期密切相關，術后MMP-9水平顯著降低；Sier等[9]的研究則提示胃癌組織中MMP-9高表達與預后不良相關，可作為胃癌預后的獨立預測指標。綜合本研究以及上述研究結果，血清MMP-9水平與癌組織MMP-9表達一樣可反映胃癌的侵襲、進展和轉移，是值得重視的胃癌監(jiān)測指標。

MMPs/TIMPs(MMPs組織抑制劑)是維持ECM動態(tài)平衡的重要環(huán)節(jié)，決定了ECM的降解程度，兩者活性失衡可促進惡性腫瘤浸潤和轉移。NGAL是Kjeldsen等[10]在1993年分離、純化得到的與人MMP-9結合的蛋白，相對分子質量為25 kDa(1 Da=0.992 1 u)，可拮抗TIMP-1對MMP-9的抑制作用以維持其活性，促進ECM降解。在腫瘤細胞微環(huán)境中，最早出現(xiàn)的變化是上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，研究[11]表明NGAL可通過EMT關鍵轉錄因子Slug誘導EMT，進而促進某些腫瘤細胞(如人乳腺癌細胞)遷移和侵襲，參與腫瘤進展。而在另一些腫瘤細胞中(如4T1-Ras-轉化腫瘤細胞)，NGAL則可逆轉EMT(即誘導間質-上皮轉化)，表現(xiàn)為抑制腫瘤細胞侵襲和轉移[12]。在高轉移性和低轉移性結腸癌細胞株中，NGAL表達與細胞轉移潛能呈負相關，在高轉移性、低NGAL表達的結腸癌細胞株中過表達NGAL能顯著抑制其侵襲和肝轉移[13]。此外，NGAL在腫瘤組織中的表達有明顯異質性，如在肺、結腸、胰腺癌中高表達，在腎、前列腺癌中低表達，淋巴和胸腺腫瘤不表達NGAL[14]。NGAL在不同類型腫瘤和細胞株中對侵襲、轉移的不同影響可能與激活不同信號通路有關。

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者的血清NGAL水平顯著高于健康人，其中有遠處轉移者顯著高于無遠處轉移者，且隨TNM分期進展而增高，提示NGAL參與促進胃癌進展和轉移。Kubben等[15]的研究顯示胃癌組織中的MMP-9/NGAL復合物表達與Lauren分型、WHO分型和預后不良顯著相關。上述結果提示檢測胃癌患者的血清NGAL水平對胃癌的預后評估可能有一定價值。盡管NGAL與MMP-9在功能上存在一定聯(lián)系，但本研究相關性分析卻未提示胃癌患者中兩者的血清水平存在相關關系，可能與不同胃癌患者的NGAL表達存在異質性有關。

由于多種惡性腫瘤患者均存在血清MMP-9、NGAL表達異常，故其檢測對胃癌診斷缺乏特異性，但作為胃癌高危人群的篩查指標可能仍有一定價值。本研究應用ROC曲線評價了血清MMP-9、NGAL篩查胃癌的診斷性能，結果顯示取最佳臨界值時，兩者的敏感性分別為64.5%和85.5%，特異性均為90.0%，如采用并聯(lián)試驗，敏感性可提高至94.7%，特異性則略有降低(82.0%)。鑒于血清MMP-9、NGAL水平均隨胃癌TNM分期進展而增高，與TNM分期間存在顯著正相關關系，故亦可考慮作為判斷胃癌進展和預后的血清學指標。

綜上所述，MMP-9、NGAL在胃癌侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用，兩者在胃癌患者中的血清水平顯著增高并與腫瘤進展相關，可能作為胃癌篩查、病情判斷和預后評估的潛在指標。由于本研究樣本量小、時間跨度短，研究結論尚需擴大樣本量、完善隨訪并開展多中心臨床試驗以進一步驗證。

1 Li X, Wu JF. Recent developments in patent anti-cancer agents targeting the matrix metalloproteinases (MMPs)[J]. Recent Pat Anticancer Drug Discov, 2010, 5 (2): 109-141.

2 Fingleton B. Matrix metalloproteinases: roles in cancer and metastasis[J]. Front Biosci, 2006, 11: 479-491.

3 Yan L, Borregaard N, Kjeldsen L, et al. The high molecular weight urinary matrix metalloproteinase (MMP) activity is a complex of gelatinase B/MMP-9 and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL). Modulation of MMP-9 activity by NGAL[J]. J Biol Chem, 2001, 276 (40): 37258-37265.

4 Wang LH, Li LH, Lv S, et al. Lymphatic metastasis is related to the epithelial-mesenchymal transition and expressions of VEGF, MMP-9, and COX-2 in breast cancer[J]. Front Med China, 2009, 3 (2): 164-170.

5 Matsuyama Y, Takao S, Aikou T. Comparison of matrix metalloproteinase expression between primary tumors with or without liver metastasis in pancreatic and colorectal carcinomas[J]. J Surg Oncol, 2002, 80 (2): 105-110.

6 Shekhar MP, Werdell J, Santner SJ, et al. Breast stroma plays a dominant regulatory role in breast epithelial growth and differentiation: implications for tumor development and progression[J]. Cancer Res, 2001, 61 (4): 1320-1326.

7 Kabashima A, Maehara Y, Kakeji Y, et al. Clinico-pathological features and overexpression of matrix metalloproteinases in intramucosal gastric carcinoma with lymph node metastasis[J]. Clin Cancer Res, 2000, 6 (9): 3581-3584.

8 Torii A, Kodera Y, Uesaka K, et al. Plasma concentration of matrix metalloproteinase 9 in gastric cancer[J]. Br J Surg, 1997, 84 (1): 133-136.

9 Sier CF, Kubben FJ, Ganesh S, et al. Tissue levels of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 are related to the overall survival of patients with gastric carcinoma[J]. Br J Cancer, 1996, 74 (3): 413-417.

10 Kjeldsen L, Johnsen AH, Sengel?v H, et al. Isolation and primary structure of NGAL, a novel protein associated with human neutrophil gelatinase[J]. J Biol Chem, 1993, 268 (14): 10425-10432.

11 Yang J, Bielenberg DR, Rodig SJ, et al. Lipocalin 2 promotes breast cancer progression[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106 (10): 3913-3918.

12 Hanai J, Mammoto T, Seth P, et al. Lipocalin 2 diminishes invasiveness and metastasis of Ras-transformed cells[J]. J Biol Chem, 2005, 280 (14): 13641-13647.

13 Lee HJ, Lee EK, Lee KJ, et al. Ectopic expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin suppresses the invasion and liver metastasis of colon cancer cells[J]. Int J Cancer, 2006, 118 (10): 2490-2497.

14 Friedl A, Stoesz SP, Buckley P, et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin in normal and neoplastic human tissues. Cell type-specific pattern of expression[J]. Histochem J, 1999, 31 (7): 433-441.

15 Kubben FJ, Sier CF, Hawinkels LJ, et al. Clinical evidence for a protective role of lipocalin-2 against MMP-9 autodegradation and the impact for gastric cancer[J]. Eur J Cancer, 2007, 43 (12): 1869-1876.