肖 瀟 卞兆連 苗 琪 王綺夏 張海燕 馬 雄

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所(200001)

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一種自身免疫介導(dǎo)的慢性膽汁淤積性肝病，臨床表現(xiàn)以血清抗線粒體抗體(AMA)陽性、IgM升高、肝臟生化指標(biāo)異常為特征，組織病理學(xué)表現(xiàn)為以小葉間膽管為中心的炎性細(xì)胞浸潤、小膽管增生以及膽汁淤積，可慢性進(jìn)展至肝纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化[1]。目前PBC的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，除遺傳和環(huán)境因素外，自身抗體、多種免疫細(xì)胞以及細(xì)胞因子共同參與了疾病發(fā)生。白細(xì)胞介素-9(IL-9)因可促進(jìn)T細(xì)胞、肥大細(xì)胞生長而被稱為T細(xì)胞、肥大細(xì)胞生長因子，并被歸入Th2型細(xì)胞因子。此外，IL-9還在變態(tài)反應(yīng)性疾病和自身免疫性疾病(如哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥等)中發(fā)揮多向免疫調(diào)節(jié)功能[2-3]。目前尚無關(guān)于IL-9與PBC的研究。本研究通過檢測PBC患者血清和肝組織中的IL-9表達(dá)，分析其與臨床指標(biāo)和肝組織病理分期的關(guān)系，旨在闡明IL-9在PBC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

對(duì)象與方法

一、 研究對(duì)象

納入2012年1月-2013年7月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科確診的PBC患者30例。根據(jù)2009年美國肝病研究學(xué)會(huì)(AASLD)更新的PBC診斷和治療指南[4]，診斷PBC需符合下列3項(xiàng)診斷標(biāo)準(zhǔn)中的兩項(xiàng)：①膽汁淤積的生化學(xué)表現(xiàn)；②AMA陽性；③非化膿性破壞性膽管炎和小葉間膽管損傷的組織學(xué)表現(xiàn)。30例患者中20例行肝穿刺活檢，根據(jù)Scheuer評(píng)分系統(tǒng)[5]對(duì)標(biāo)本進(jìn)行病理分期：Ⅰ期為小膽管炎期，Ⅱ期為細(xì)小膽管增生期，Ⅲ期為瘢痕期，Ⅳ期為肝硬化期。選取同期10名健康體檢者和4例來自肝血管瘤切除標(biāo)本的遠(yuǎn)端正常肝組織作為正常對(duì)照組。研究方案經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者本人或法定代理人簽署知情同意書。

二、方法

1. 主要試劑：ELISA試劑盒購自美國Bio-Legend公司，兔抗人IL-9抗體購自美國Abcam公司，即用型免疫組化超敏試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

2. 血清IL-9水平以及生化、免疫指標(biāo)測定：抽取PBC組、正常對(duì)照組受檢者外周靜脈血5 mL，2 h內(nèi)1 000×g離心10 min，提取上層血清保存于-80 ℃，采用ELISA法檢測血清IL-9水平，具體步驟參照ELISA試劑盒說明書。采用自動(dòng)生化儀和散射免疫比濁法檢測血清生化和免疫指標(biāo)，包括ALT、AST、ALP、GGT、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、IgG、IgM、IgA。

3. 肝組織IL-9免疫組化染色：取20例PBC、4例正常對(duì)照肝組織標(biāo)本，4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，二甲苯、乙醇梯度脫蠟。PBS洗滌3次后，以3% H2O2作用15 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，檸檬酸鹽緩沖液熱修復(fù) 15 min，自然冷卻至室溫。非免疫羊血清室溫封閉 30 min，滴加兔抗人IL-9抗體(1∶100)，4 ℃過夜，次日滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。顯微鏡下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)門管區(qū)，計(jì)數(shù)每個(gè)門管區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)量，取平均值行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

PBC組患者30例，其中男3例，女27例，年齡25～70歲，平均(47.3±15.6)歲。正常對(duì)照組10例，其中男2例，女8例，年齡26～66歲，平均(49.1±13.8)歲。兩組間性別構(gòu)成、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。20例肝穿刺標(biāo)本病理分期示Ⅰ期4例，Ⅱ期8例，Ⅲ期5例，Ⅳ期3例。

二、血清IL-9水平及其與生化、免疫指標(biāo)的相關(guān)性

PBC組血清IL-9、ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL水平均較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)(圖1A、表1)。Pearson相關(guān)系數(shù)分析顯示，PBC組血清IL-9與IgG水平呈正相關(guān)(r=0.681，P<0.01)(圖1B)，與ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL、IgM、IgA水平均無相關(guān)性(P>0.05)。

三、肝組織IL-9表達(dá)及其與病理分期的相關(guān)性

肝組織免疫組化染色結(jié)果顯示，IL-9陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕褐色；正常肝組織幾乎無IL-9陽性細(xì)胞，PBC肝組織中有少量IL-9陽性細(xì)胞，主要集中于門管區(qū)，兩組間IL-9陽性細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2A、2B)。Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)分析顯示，門管區(qū)IL-9陽性細(xì)胞數(shù)量與肝組織病理分期呈正相關(guān)(rs=0.465，P<0.05)(圖2C)。

表1 PBC組和正常對(duì)照組血清生化、免疫指標(biāo)比較

討 論

IL-9屬于四螺旋束細(xì)胞因子家族，可由Th17、Th9、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)等CD4+T細(xì)胞亞群合成、分泌[6]。IL-9受體(IL-9R)是由IL-9R α和γc鏈組成的異二聚體，廣泛分布于Th9、Th17、Treg細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等表面。以IL-9/IL-9R軸為基礎(chǔ)，IL-9可作用于不同免疫細(xì)胞，發(fā)揮多向免疫調(diào)節(jié)功能。對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠(多發(fā)性硬化模型)的研究[2]顯示，中和小鼠體內(nèi)IL-9可延緩疾病發(fā)生，而IL-9R缺陷可減輕疾病嚴(yán)重程度。Elyaman等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，IL-9可由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，并與轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)協(xié)同促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，且不依賴于IL-6信號(hào)途徑。Khan等[8]在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中檢測到血清IL-9水平升高，予利妥昔單抗治療后，IL-9水平明顯降低。上述研究提示IL-9可能通過其受體在自身免疫性疾病中發(fā)揮促炎作用。此外，研究[7]還發(fā)現(xiàn)IL-9能增強(qiáng)Treg細(xì)胞在體外的免疫抑制功能，從而發(fā)揮抗炎作用。目前，關(guān)于IL-9與肝臟疾病的關(guān)系已有多項(xiàng)研究報(bào)道，如在藥物引起的肝損傷中，IL-9水平降低與早期死亡率增加相關(guān)[9]；在肝移植患者中，IL-9水平升高者對(duì)免疫抑制劑的應(yīng)答更好[10]。

A：PBC組、正常對(duì)照組血清IL-9水平比較；B：PBC組血清IL-9水平與IgG水平的相關(guān)性

A: PBC組、正常對(duì)照組肝組織IL-9免疫組化染色(×200)；B: PBC組、正常對(duì)照組肝組織門管區(qū)IL-9陽性細(xì)胞數(shù)量比較；C: PBC組肝組織中的IL-9陽性細(xì)胞數(shù)量與病理分期的相關(guān)性

PBC是一種以肝臟為相對(duì)特異性免疫病理損傷器官的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。隨著實(shí)驗(yàn)小鼠模型的建立和新技術(shù)的發(fā)展，PBC相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制得到了進(jìn)一步的揭示。研究[11]發(fā)現(xiàn)自身反應(yīng)性T細(xì)胞在dnTGF-β受體Ⅱ轉(zhuǎn)基因小鼠模型和人類PBC肝組織中大量浸潤，可能在膽管上皮損傷中起主要作用。多種CD4+效應(yīng)T細(xì)胞和細(xì)胞因子失衡在PBC致病過程中亦發(fā)揮重要作用。PBC患者肝組織中的干擾素-γ(IFN-γ)、IL-17、IL-23 表達(dá)明顯增加，而IL-10表達(dá)明顯減少[12-13]。Kawata等[14]對(duì)2-辛炔酸-牛血清白蛋白耦合物(2OA-BSA)誘導(dǎo)的PBC小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，敲除IL-12p40和IFN-γ可抑制膽管炎發(fā)生，提示IL-12、IFN-γ對(duì)膽管炎的發(fā)展至關(guān)重要。該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，IL-17A和IL-22缺失可減輕膽管炎癥，提示IL-23/Th17通路可增強(qiáng)IL-12、IFN-γ介導(dǎo)的免疫損傷。此外，IL-2受體α(CD25)-/-小鼠是國際公認(rèn)的PBC模型，對(duì)模型小鼠的研究提示Treg細(xì)胞(CD4+CD25+T細(xì)胞)功能缺陷可能在PBC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[15]。作為新近鑒定的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞和細(xì)胞因子，Th9細(xì)胞和IL-9是否參與PBC的致病過程尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者外周血和肝組織中的IL-9均呈高表達(dá)，提示IL-9參與了PBC的致病過程。在PBC患者中，血清IgG水平可反映肝組織門管區(qū)炎癥和小葉壞死程度[4]，肝組織病理分期則與肝纖維化程度密切相關(guān)。本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)PBC患者血清IL-9水平與IgG水平呈正相關(guān)，提示血清IL-9水平亦能反映PBC肝組織門管區(qū)炎癥程度，IL-9或參與了肝組織炎癥損傷過程。此外，相關(guān)性分析還顯示PBC肝組織中的IL-9陽性細(xì)胞數(shù)量與病理分期呈正相關(guān)，提示IL-9可能參與了PBC的肝組織纖維化過程。

綜上所述，本研究結(jié)果提示IL-9可能在PBC肝組織炎癥損傷和纖維化過程中發(fā)揮重要作用，然而IL-9是否通過Th17或其他靶細(xì)胞參與PBC的致病過程仍有待進(jìn)一步研究。IL-9信號(hào)通路阻斷劑或能成為PBC的靶向治療藥物。

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