慕剛剛 于紅剛 李紅艷 李 維

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科1(430060) 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院綜合內(nèi)科2

胰腺癌是極度惡性的消化道腫瘤，位居癌癥死亡原因的第四位，過(guò)去10年間胰腺癌發(fā)病率逐年上升，全世界每年約227 000例患者死于胰腺癌，其5年生存率不足5%[1-2]。胰腺癌早期診斷困難，確診時(shí)多已發(fā)生局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，喪失了早期手術(shù)切除的機(jī)會(huì)[3]。胰腺癌的高轉(zhuǎn)移率歸因于胰腺癌細(xì)胞的強(qiáng)運(yùn)動(dòng)、侵襲能力，目前吉西他濱等一線化療藥物對(duì)抑制胰腺癌的轉(zhuǎn)移效果欠佳，且多有化療耐藥性產(chǎn)生。研發(fā)有效抑制胰腺癌細(xì)胞黏附、侵襲運(yùn)動(dòng)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的輔助化療方式已成為目前胰腺癌研究的重點(diǎn)。

在眾多新型化療藥物的研究中，天然形式的百里醌(thymoquinone)受到越來(lái)越多的關(guān)注，1963年人們首次從黑種草(Nigella sativa)草籽中提取出具有多種生物活性的百里醌，其能有效抗氧化、抗炎癥，對(duì)糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化有較好的療效[4]。百里醌還能有效抑制多種人腫瘤細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、遷移以及腫瘤新生血管生成等腫瘤生物學(xué)特性[5]。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明百里醌能抑制結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[6-8]。對(duì)人正常前列腺上皮細(xì)胞、小腸細(xì)胞、胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞作用的研究表明百里醌對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性損害作用[7,9-10]。本研究通過(guò)探討百里醌對(duì)人胰腺癌細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)、侵襲的作用及其可能的調(diào)控機(jī)制，旨在為百里醌能運(yùn)用于胰腺癌的臨床輔助化療提供有效依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

胎牛血清、RPMI-1640、青霉素-鏈霉素抗菌藥物購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。Boyden小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；MatrigelTM基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。兔抗β-actin、FAK、磷酸化Akt(Ser 473)抗體、小鼠抗Akt抗體、羊抗兔IgG (H+L)、F(ab’)2Fragment(Alexa Fluor?555 Conjugate)熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology, Inc，纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)標(biāo)記的抗體Acti-stainTM488 Fluorescent Phalloidin購(gòu)自Cytoskeleton，Inc.；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；細(xì)胞核染色液4’，6 - 二脒-2’-苯基吲哚二鹽酸鹽(4’, 6-Diamidino-2’-phenylindole dihydrochloride， DAPI)購(gòu)自Roche公司；百里醌購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。BxPC-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、適合濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至約70%～80%密度時(shí)經(jīng)胰酶消化傳代培養(yǎng)。

2. 侵襲實(shí)驗(yàn)：將MatrigelTM基質(zhì)膠4 ℃過(guò)夜溶解。經(jīng)稀釋的MatrigelTM基質(zhì)膠40 μL/室包被Boyden小室內(nèi)室底膜，4 ℃過(guò)夜，使用前加200 μL RPMI-1640于37 ℃水化30 min。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BxPC-3細(xì)胞，用含0.1% BSA的RPMI-1640培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液1×106個(gè)/mL，取200 μL細(xì)胞懸液加入Boyden小室的內(nèi)室(孔徑8 μm)，其中包含不同濃度的百里醌(0、10、25 μmol/L)，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液600 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用棉球小心拭去內(nèi)室培養(yǎng)液和細(xì)胞，將內(nèi)室用4%多聚甲醛溶液固定15 min，Giemsa染色10 min，置于倒置顯微鏡下觀察。每個(gè)小室高倍鏡下(×200)隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)各組穿透細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲率(%)=(對(duì)照組平均穿透細(xì)胞數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均穿透細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組平均穿透細(xì)胞數(shù)×100%。

3. 運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)：基本步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同，僅Boyden小室內(nèi)室不包被MatrigelTM基質(zhì)膠。

4. 蛋白質(zhì)印跡法：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BxPC-3細(xì)胞，按1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種至6孔板，待貼壁生長(zhǎng)至70%～80%密度，分別給予0、10、25、50 μmol/L百里醌處理24 h。培養(yǎng)終止后，PBS洗滌2遍，加入細(xì)胞裂解液充分裂解并離心提取總蛋白。BCA法測(cè)定總蛋白濃度，取40 μg總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉/10% BSA溶液封閉非特異性位點(diǎn)。加入FAK、磷酸化Akt、Akt一抗(工作濃度均為1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h；漂洗后經(jīng)ECL法顯色，X線膠片曝光。以β-actin蛋白為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

5. 免疫熒光：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BxPC-3細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104～3×104個(gè)/mL，接種于無(wú)菌蓋玻片。加入0、25 μmol/L百里醌培養(yǎng)12 h。PBS洗滌3遍，用預(yù)熱的4%多聚甲醛溶液固定15 min，0.3% Triton-X 100/PBS溶液穿透15 min，5% BSA/PBS+山羊非免疫血清溶液封閉1 h去除非特異性結(jié)合；加入1∶100稀釋的兔抗FAK一抗溶液，4 ℃濕盒孵育過(guò)夜；PBS洗滌3遍后加入1∶1 000稀釋的羊抗兔IgG(H+L)、F(ab’)2Fragment(Alexa Fluor?555 Conjugate)熒光二抗和1∶200稀釋的Acti-stainTM488 Fluorescent Phalloidin抗體，室溫濕盒孵育60 min；0.1 μg/mL DAPI染核 1 min，充分洗滌后用抗熒光淬滅劑封片；Olympus熒光顯微鏡下觀察。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、百里醌對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響

空白對(duì)照組、10 μmol/L、25 μmol/L百里醌組穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)分別為145±9、82±10、38±7，與空白對(duì)照組相比，10、25 μmol/L百里醌組細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)透膜數(shù)顯著減少(P<0.05)，且25 μmol/L組細(xì)胞遷移數(shù)又明顯少于10 μmol/L組(P<0.05)(圖1)。兩組百里醌組的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)抑制率分別為43.4%、73.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明百里醌能呈濃度依賴性地抑制人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的體外運(yùn)動(dòng)。

二、百里醌對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞侵襲能力的影響

空白對(duì)照組、10 μmol/L、25 μmol/L百里醌組透膜細(xì)胞數(shù)分別為119±10、47±6、29±5，與空白對(duì)照組相比，10 μmol/L、25 μmol/L百里醌組BxPC-3細(xì)胞侵襲透膜數(shù)均顯著減少(P<0.05)，且25 μmol/L組細(xì)胞侵襲透膜數(shù)又明顯少于10 μmol/L組(P<0.05)(圖1)。兩組百里醌組的侵襲抑制率分別為60.5%、75.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明百里醌能呈濃度依賴性地抑制人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的體外侵襲。

三、百里醌對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞FAK表達(dá)、 磷酸化Akt的影響

與空白對(duì)照組相比，10 μmol/L百里醌組BxPC-3細(xì)胞FAK表達(dá)、磷酸化Akt水平無(wú)明顯差異，而25、50 μmol/L百里醌組能明顯下調(diào)FAK、磷酸化Akt的表達(dá)，但25 μmol/L與50 μmol/L組間FAK、磷酸化Akt水平無(wú)明顯差異；各組間總Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(圖2)。說(shuō)明百里醌能明顯抑制BxPC-3細(xì)胞FAK表達(dá)和Akt Ser 473位點(diǎn)的磷酸化激活。

*與空白對(duì)照組比較，P<0.05

1 Da=0.992 1 u

四、百里醌對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞FAK定位、黏著斑形成和F-actin集化的影響

25 μmol/L百里醌組BxPC-3細(xì)胞FAK表達(dá)明顯減少，F(xiàn)AK標(biāo)記的黏著斑面積明顯縮小，彌散分布于胞質(zhì)，胞膜和細(xì)胞邊緣區(qū)聚集較少；F-actin多呈點(diǎn)狀分布，無(wú)明顯集化現(xiàn)象。而空白對(duì)照組細(xì)胞具有更強(qiáng)熒光標(biāo)記的FAK表達(dá)，F(xiàn)AK表達(dá)量明顯較多，且黏著斑面積較大，數(shù)目較多，多集中在細(xì)胞膜邊緣區(qū)；F-actin多有集化，且與胞膜的黏著斑緊密相連，細(xì)胞骨架多向黏著斑分布密集區(qū)聚集(圖3)。表明百里醌能明顯抑制細(xì)胞黏著斑的形成，下調(diào)FAK表達(dá)，同時(shí)抑制F-actin集化的發(fā)生，進(jìn)而降低細(xì)胞的黏附、侵襲和運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移。

圖3 百里醌對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞FAK、黏著斑和F-actin的影響(箭頭所示處為FAK定位)

討 論

天然植物單體百里醌能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)、體外的凋亡，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等[5]。有研究[10]證實(shí)百里醌同樣能有效抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但又不影響人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。進(jìn)一步對(duì)百里醌影響腫瘤其他生物學(xué)行為的研究[11-13]發(fā)現(xiàn)，其能有效抑制腫瘤新生血管的生成、增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性、抑制腫瘤細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)等。

胰腺癌的轉(zhuǎn)移一個(gè)多步驟、多因素的過(guò)程，包括上皮細(xì)胞極性改變、腫瘤細(xì)胞間黏附改變、運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)、癌細(xì)胞穿透基底膜、轉(zhuǎn)移灶新生血管生成等一系列變化[5]。其中腫瘤細(xì)胞依賴黏著斑黏附到細(xì)胞外基質(zhì)、破壞基底膜侵入血管或淋巴管是關(guān)鍵步驟，該過(guò)程需要腫瘤細(xì)胞的趨化性運(yùn)動(dòng)、侵入基底層的能力和單個(gè)細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力。癌細(xì)胞在遷移運(yùn)動(dòng)時(shí)，引導(dǎo)端形成大量突起，觸發(fā)肌動(dòng)蛋白的聚合集化和尾端的收縮協(xié)調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞通過(guò)肌動(dòng)球蛋白張力纖維產(chǎn)生對(duì)抗黏附的牽引力，促進(jìn)細(xì)胞向引導(dǎo)端遷移運(yùn)動(dòng)。癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)還涉及多種黏附蛋白、激酶、細(xì)胞因子及其所參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控，其中FAK是參與細(xì)胞黏著斑形成、翻轉(zhuǎn)的關(guān)鍵激酶[14]，同時(shí)也是誘導(dǎo)細(xì)胞骨架和引導(dǎo)端突起形成的關(guān)鍵信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白。腫瘤細(xì)胞黏附時(shí)FAK發(fā)生活化，通過(guò)FAK-Src-Cas-Crk-Dock180/Ras、FAK-PI3K/Akt等多種信號(hào)通路的激活介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的極化、運(yùn)動(dòng)、侵襲，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和惡化[15-16]。目前已知FAK在腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中明顯高表達(dá)，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)[17-19]。

Kolli-Bouhafs等[20]的研究發(fā)現(xiàn)百里醌通過(guò)抑制FAK的活化來(lái)抑制人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，這與本研究發(fā)現(xiàn)百里醌能抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞中FAK表達(dá)、阻斷黏著斑的形成以及抑制F-actin聚合集化的結(jié)果相一致。FAK表達(dá)下調(diào)、活性降低依賴細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)腫瘤侵襲、遷移相關(guān)的廣泛信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白的改變，如細(xì)胞外基質(zhì)中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-2、-9的活性下調(diào)、ERK或PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路的抑制、F-actin的解聚等，這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)直接或間接抑制了腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力的降低。本研究中百里醌呈濃度依賴性地抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的體外運(yùn)動(dòng)、侵襲，且FAK表達(dá)下調(diào)，磷酸化Akt的激活受抑，說(shuō)明百里醌可能是通過(guò)抑制FAK表達(dá)和Akt磷酸化水平來(lái)降低胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的體外運(yùn)動(dòng)、侵襲能力。

綜上所述，百里醌通過(guò)下調(diào)FAK的表達(dá)，抑制黏著斑的形成和引導(dǎo)端聚集，繼而抑制Akt磷酸化水平，通過(guò)抑制FAK/PI3K/Akt通路，間接抑制人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，但具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究也為百里醌未來(lái)應(yīng)用于胰腺癌的輔助化療提供了新的證據(jù)。

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