霍平慧，師尚禮，苗陽(yáng)陽(yáng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

與自然存在的土著根瘤菌比，人工選育的根瘤菌常具有固氮效率高、促生效果好等優(yōu)勢(shì)。但釋放到田間的目標(biāo)根瘤菌，需要與環(huán)境中的土著根瘤菌以及其他影響目標(biāo)菌結(jié)瘤的雜菌在營(yíng)養(yǎng)、空間及宿主等方面進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)[1]。我國(guó)西北內(nèi)陸土壤相對(duì)貧瘠的現(xiàn)狀使得豆科牧草的根瘤菌接種效率低下[2]。目前多采用篩選抗性菌株的方法提高菌種適應(yīng)性，以增加其在不同環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)能力。此外，所篩選的高效根瘤菌一旦投入生產(chǎn)，制成商業(yè)化產(chǎn)品根瘤菌劑后，還面臨著貯藏期間因空氣中雜菌入侵所導(dǎo)致的高污染率問(wèn)題[3,4]。因此，常通過(guò)向菌劑中添加抑菌劑的措施降低菌劑污染率并增加其施用到田間后的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力[5,6]。

對(duì)有關(guān)3種稀土鹽抑菌劑La(NO3)3·6H2O，LaCl3和Ce(NO3)3·6H2O及2種植物源抑菌劑苦參堿，除蟲菊素的研究發(fā)現(xiàn)[7,8]，上述抑菌劑均對(duì)空氣和土壤源雜菌有較好的抑制效果。在此基礎(chǔ)上明確所篩選根瘤菌對(duì)以上所說(shuō)抑菌劑的耐受程度，對(duì)于制備高競(jìng)爭(zhēng)型抗污染根瘤菌劑至關(guān)重要，同時(shí)也是后續(xù)菌劑制備工作進(jìn)行的基礎(chǔ)。有效選擇對(duì)空氣及土壤源雜菌抑制效果好、而對(duì)根瘤菌的選擇毒性低的抑菌劑類型，可降低所制備菌劑的污染率并增加目的菌株施用到田間后的競(jìng)爭(zhēng)效果。此外，針對(duì)根瘤菌研究中占瘤率測(cè)定難的現(xiàn)狀，以研究方法檢測(cè)靈敏度高、對(duì)試驗(yàn)材料無(wú)能源負(fù)擔(dān)為基本原則[9]，對(duì)所篩選根瘤菌進(jìn)行青色熒光蛋白(cfp)標(biāo)記，并測(cè)定標(biāo)記根瘤菌對(duì)抑菌劑的耐受性變化，以達(dá)到能夠更加簡(jiǎn)單的識(shí)別目標(biāo)根瘤菌，并降低后續(xù)工作的強(qiáng)度和技術(shù)成本的目的，以期為后期所接種根瘤菌回接效果以及所制備菌劑抗污染效果的測(cè)定提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物材料 2012年6月，于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蘭州牧草試驗(yàn)站選取6個(gè)苜蓿品種。各苜蓿品種的根瘤分別取自多于3處栽培地的生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害、根瘤數(shù)多且顏色粉紅的苜蓿植株。

1.1.2 供試抑菌劑材料 稀土鹽抑菌劑La(NO3)3·6H2O,LaCl3和Ce(NO3)3·6H2O，購(gòu)自五礦(北京)稀土研究院有限公司，為常規(guī)農(nóng)用稀土，具有抗炎、殺菌等藥理活性。

表1 苜蓿品種及來(lái)源

植物源抑菌劑，苦參堿和除蟲菊素，購(gòu)自寶雞方晟生物開(kāi)發(fā)有限公司，均為植物源殺蟲劑?？鄥A主要以其生物堿成分發(fā)揮抑菌作用，對(duì)昆蟲、病原菌的毒力較強(qiáng)，對(duì)人畜的選擇毒性低；除蟲菊素屬神經(jīng)毒劑，主要起觸殺作用，對(duì)高等動(dòng)物低毒，見(jiàn)光后可緩慢分解為水和CO，環(huán)保無(wú)公害。

1.2 根瘤菌的分離與鑒定

1.2.1 苜蓿根瘤的分離與處理 將各品種苜蓿植株根系挖出后，以自來(lái)水淋洗根系表面附著的土壤和有機(jī)質(zhì)，取下根系上顏色偏紅和偏粉紅的根瘤，置于無(wú)菌三角瓶中，加醫(yī)用碘伏溶液震蕩滅菌2 min后，以無(wú)菌水沖洗，重復(fù)上述過(guò)程3次。最后用無(wú)菌濾紙吸干根瘤表面水分待用。

根瘤表面處理藥劑，醫(yī)用碘伏消毒液(聚乙烯吡咯烷酮碘)，稀釋一倍后有效碘濃度為2 500 mg/L。將表面滅菌處理苜蓿根瘤置于無(wú)菌研缽中，加入5 mL無(wú)菌水，充分研磨后，將組織勻漿轉(zhuǎn)入5 mL無(wú)菌離心管中，于4 000 r/min離心10 min，取上清液，并依次用無(wú)菌水配制10-3、10-4、10-5稀釋液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 根瘤菌的篩選鑒定 將各品種苜蓿根瘤研磨上清液及稀釋液均勻涂抹于無(wú)氮固體培養(yǎng)基，28 ℃下恒溫培養(yǎng)6～7 d后選取各平板中的單菌落進(jìn)行菌株分離。將分離的固氮菌株分別劃線接種于含有剛果紅和結(jié)晶紫的YMA固體培養(yǎng)基上，28 ℃下恒溫培養(yǎng)，48 h后挑選每培養(yǎng)皿中不吸附色素并符合根瘤菌形態(tài)特征的典型菌株進(jìn)行劃線分離純化[10]，待菌落直徑長(zhǎng)至最大時(shí)，測(cè)量并記錄各菌株菌落形態(tài)(直徑、外觀、粘稠度)。

溴麝香草酚蘭(BTB)反應(yīng) 向YMA基本培養(yǎng)基中添加終濃度為0.5%的溴麝香草酚藍(lán)的乙醇溶液。將菌株接種于含BTB的平板，培養(yǎng)48 h后，觀察菌落周圍培養(yǎng)基顏色的變化情況。

3-酮基乳糖反應(yīng) 將各菌株點(diǎn)接于添加乳糖的YMA平板中,以不添加乳糖的平板為對(duì)照,培養(yǎng)48 h后向皿中菌落滴加本尼迪試劑(Benedict) 覆蓋菌苔。菌落周圍出現(xiàn)黃褐色沉淀者為陽(yáng)性反應(yīng),未出現(xiàn)黃褐色沉淀者為陰性反應(yīng)。

接觸酶反應(yīng) 將供試菌株點(diǎn)接于YMA培養(yǎng)基上,待菌苔長(zhǎng)出后,滴加3%的H2O2溶液并立即檢查結(jié)果，5 min內(nèi)出現(xiàn)氣泡者為陽(yáng)性反應(yīng)，未出現(xiàn)氣泡則為陰性反應(yīng)[11]。

碳源利用類型 以YMA固體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并分別用淀粉、乳糖、檸檬酸、蔗糖、果糖和葡萄糖作為唯一碳源，測(cè)定各菌株的碳源利用特性。

革蘭氏染色反應(yīng) 對(duì)上述過(guò)程中有待進(jìn)一步篩選的初篩菌株進(jìn)行革蘭氏染色，將所有制備好的染色載波片置于蔡司熒光倒置顯微鏡下觀察染色后的菌株顏色及形態(tài)特征。

上述試驗(yàn)中，所有測(cè)定菌株均設(shè)3個(gè)陽(yáng)性重復(fù)和1個(gè)陰性對(duì)照，并對(duì)各品種苜蓿根瘤中生化特性符合的篩選菌株進(jìn)行編號(hào)保存，作為符合根瘤菌基本特征的初篩菌株。以購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物保藏中心的中華苜蓿根瘤菌S.12531 (Sinorhizobiummeliloti/Ensifermeliloti) 為對(duì)照菌株，以實(shí)驗(yàn)室保存的R.GN5 (RzhizobiumGN5) 根瘤菌株作為參比菌株。

1.3 含抑菌劑平板的制備及初篩根瘤菌的抑菌劑抗性測(cè)試

1.3.1 含抑菌劑平板的制備 以YMA固體培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，制備La(NO3)3·6H2O,LaCl3和Ce(NO3)3·6H2O，這3種稀土鹽離子的終濃度為200、400、600、800和1 000 mg/L的含藥平板，以及含有300、400、500、600和700 mg/L苦參堿和500、1 000、1 500和2 000 mg/L除蟲菊素的含藥平板，每處理3次重復(fù)。

1.3.2 初篩根瘤菌株的抑菌劑抗性測(cè)試 將各品種編號(hào)保存的初篩根瘤菌點(diǎn)接于含藥平板，以購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物保藏中心的中華苜蓿根瘤菌S.12531為對(duì)照菌株，以實(shí)驗(yàn)室保存的R.GN5(RzhizobiumGN5) 根瘤菌株為參比菌株，測(cè)定各篩選根瘤菌的抑菌劑抗性。

將1.3.2中對(duì)高濃度抑菌劑耐受性較好的根瘤菌株送往中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心進(jìn)行生化指標(biāo)鑒定并測(cè)定16sRNA序列。得到1株編號(hào)為L(zhǎng)H3436的苜蓿根瘤菌(343-6)，為對(duì)0.6 mg/mL苦參堿具有耐受性的根瘤菌株。

1.4 熒光標(biāo)記根瘤菌的構(gòu)建

1.4.1 供試菌株活化 供體菌株E.colipMP 4517，含有cfp(青色熒光蛋白)，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，無(wú)法在SM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，對(duì)慶大霉素有抗性(Gmr)；

輔助菌株E.colipRK2073，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，無(wú)法在SM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，對(duì)壯觀霉素有抗性(Sper)；

受體菌株1S.12531，標(biāo)準(zhǔn)菌，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物保藏中心；

受體菌株2R.GN5，實(shí)驗(yàn)室保存的苜蓿根瘤菌；

受體菌株3R.LH3436，1.3.2中篩選出的對(duì)苦參堿抑菌劑具有優(yōu)良抗性的苜蓿根瘤菌。

抗生素平板制備，將0.22 μm濾膜過(guò)濾滅菌的高濃度Gm和Spe母液于TY/LB/SM固體培養(yǎng)基冷卻至40 ℃加入，使其終濃度分別為40 μg/mL和20 μg/mL。

1.4.2 受體菌感受態(tài)菌株制備 受體菌于28 ℃下YMA固體培養(yǎng)基中活化24 h，轉(zhuǎn)入YMA液體培養(yǎng)基，同一溫度下振蕩培養(yǎng)3～4 h，待菌液D600 nm達(dá)到0.4時(shí)[12]，置于冰上輕輕搖動(dòng)預(yù)冷，15 min后將冷卻菌液轉(zhuǎn)入預(yù)冷的50 mL離心管，4 ℃下3 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入15 mL預(yù)冷的0.1 mol/L的無(wú)菌CaCl2溶液，并輕搖使細(xì)胞重新懸浮，置于冰上20～30 min后再次于4 ℃下3 000 r/min離心5 min。棄上清液，加入2 mL冰上預(yù)冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液，輕搖后用于轉(zhuǎn)化或低溫冷藏備用。

1.4.3 cfp熒光標(biāo)記根瘤菌的構(gòu)建 分別在添加40 μg/mL Gm和20 μg/mL Spe的LB平板上劃線活化供體菌4 517和輔助菌2 073，在TY平板上活化受體菌。而后用接種針?lè)謩e挑取少量活化供體菌株和輔助菌株至添加40 μg/mL Gm和20 μg/mL Spe的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(D600 nm= 0.3～0.5)，挑取少量活化受體菌株至TY液體培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(D600 nm=0.5～0.8)。

將活化的供體菌、輔助菌和受體菌(感受態(tài)細(xì)胞)按1∶1∶1體積比混合，8 000 r/min 離心5 min，得到沉淀混合菌體，加1 mL TY液體培養(yǎng)基并用力搖勻后重復(fù)離心，留沉淀，重復(fù)2次，而后用200 μL的槍頭不斷抽吸沉淀菌體，得到打散的濃菌液。

在無(wú)菌狀態(tài)下將濃菌液轉(zhuǎn)移至貼于TY固體培養(yǎng)基表面的無(wú)菌濾膜上，3片/皿，28 ℃下正置培養(yǎng)，待菌液中的液體被平板吸收后，改為倒置培養(yǎng)，2～3 d后將皿中濾膜轉(zhuǎn)移至添加5 mL無(wú)菌水的西林瓶中，在漩渦振蕩器上充分打散菌體，取其10倍稀釋液0.2 mL涂抹于SM和SM+Gm固體培養(yǎng)基，28 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d，SM+Gm平板上新長(zhǎng)出的菌落即為具有Gm抗性的受體菌接合子。為進(jìn)一步確定所篩選出的接合子為熒光標(biāo)記根瘤菌，可將所有接合子分別對(duì)應(yīng)點(diǎn)接于TY和無(wú)N固體培養(yǎng)基上，綜合每一接合子在2種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，將在TY培養(yǎng)基上發(fā)黃綠色熒光并能在無(wú)N培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的接合子確定為熒光標(biāo)記根瘤菌[13]。

1.4.4 標(biāo)記根瘤菌株的抑菌劑耐受性變化檢測(cè) 參考1.3.1的方法制備不同濃度的含抑菌劑平板，將制備好的熒光標(biāo)記菌S.12531f，R.GN5f和R.LH3436f分別點(diǎn)接于各平板，觀察其抑菌劑耐受性的變化情況。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0以SNK法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌的分離過(guò)程

6個(gè)品種紫花苜蓿的根瘤中均含有大量根瘤菌。經(jīng)過(guò)形態(tài)鑒定、革蘭氏染色、剛果紅色素吸附情況以及在無(wú)氮培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況等初步鑒定手段，以各品種根瘤中初篩菌株在無(wú)氮培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度和活力狀況為主要依據(jù)，在6個(gè)品種的紫花苜蓿中共篩選出39株固氮效果好、菌種活力高的初篩菌株(表2)。各品種紫花苜蓿根瘤中固氮效果優(yōu)良的初篩菌株比例相同，其中，WL343HQ和甘農(nóng)3號(hào)2個(gè)品種中高固氮活力的菌株較多，為每個(gè)品種8株，以Qingshui較少，為5株外，其他3個(gè)品種均為6株。

表2 初篩根瘤菌株編號(hào)及寄主植株

2.2 初篩根瘤菌株的形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特性測(cè)試及抑菌劑耐受性

將初篩菌株劃線接種于YMA剛果紅培養(yǎng)基上，36 h觀察平板中單菌落形態(tài)，進(jìn)行根瘤菌的初步篩選。發(fā)現(xiàn)在39株初篩菌株中，各菌株菌落直徑為4.5～6.0 mm，其中，直徑集中在5.0和5.5 mm處。各初篩菌株均為含有粘質(zhì)胞外多糖且不吸附色素的白色半透明菌落，其形態(tài)呈平坦凸起或半球形凸起，邊緣光滑，基本符合伯杰氏菌種鑒定手冊(cè)中對(duì)根瘤菌形態(tài)的定義，可以確定為根瘤菌初篩菌株。

所有初篩39株根瘤菌株為快生型產(chǎn)酸菌，培養(yǎng)36 h時(shí)，各菌株單菌落直徑即達(dá)到4 mm以上[14]，同時(shí)均為革蘭氏陰性菌，均不能利用檸檬酸鹽，且在過(guò)氧化氫酶測(cè)試中都表現(xiàn)出陽(yáng)性反應(yīng)，試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果符合根瘤菌的生化代謝特征[15]，但所有的初篩菌株及參比菌株均可利用淀粉，這不符合根瘤菌的生理生化特性(表3)。在39株初篩的根瘤菌中，多數(shù)菌株難以利用D-果糖，但大多數(shù)可以利用乳糖。除Q-3、Q-4和Q-5不能利用葡萄糖，可以基本排除其為根瘤菌的可能性外，其他菌株均可利用葡萄糖；絕大多數(shù)菌株在3-酮基乳糖反應(yīng)中都表現(xiàn)為陰性反應(yīng)，而343-2、343-4、Q-1、G5-1、G5-5、G3-3、G3-5和G3-6為陽(yáng)性，也可以排除為根瘤菌株的可能性。

表3 初篩根瘤菌株的主要生理生化特性

注：“+”表示菌株能夠生長(zhǎng)或呈陽(yáng)性反應(yīng)，“-”表示菌株不能生長(zhǎng)或呈陰性反應(yīng)

將所有39株初篩根瘤菌及對(duì)照菌株和參比菌株點(diǎn)接于含有不同濃度梯度及類型抑菌劑的平板中，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)所有點(diǎn)接菌株均可耐受0.4 mg/mL及以下濃度的苦參堿抑菌劑，以及所有類型的0.2 mg/mL的La3+抑菌劑，并且均可耐受試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的除蟲菊素抑菌劑(表4)。La(NO3)3·6H2O濃度達(dá)到0.4 mg/mL時(shí)，所有點(diǎn)接菌株均無(wú)法長(zhǎng)出，而在同一濃度下添加CeNO3·6H2O和LaCl3的平板中，有少量點(diǎn)接菌長(zhǎng)出，La3+濃度為0.6 mg/mL時(shí)，所有點(diǎn)接根瘤菌均無(wú)法長(zhǎng)出，說(shuō)明La(NO3)3·6H2O對(duì)根瘤菌的抑制效果較CeNO3·6H2O和LaCl3強(qiáng)。在含有0.4 mg/mL苦參堿抑菌劑的平板中，仍有少量點(diǎn)接菌長(zhǎng)出，部分優(yōu)秀菌株甚至可耐受0.6 mg/mL的苦參堿抑菌劑。將表4中對(duì)某一抑菌劑耐受性較好的菌株送檢，進(jìn)行進(jìn)一步生理生化指標(biāo)的鑒定，得到LH3436菌株，為可耐受0.6 mg/mL苦參堿抑菌劑的根瘤菌。

表4 初篩根瘤菌株對(duì)各類型及濃度抑菌劑的抗性

注：“+”表示各菌株可以在平板上生長(zhǎng)，“-”表示各菌株無(wú)法在平板上生長(zhǎng)。下同

2.3 熒光標(biāo)記根瘤菌株的抑菌劑耐受性變化

將對(duì)照菌株S.12531，參比菌株R.GN5和篩選根瘤菌R.LH3436構(gòu)建熒光標(biāo)記根瘤菌后，經(jīng)過(guò)熒光活性的遺傳穩(wěn)定性測(cè)試，選取熒光活性穩(wěn)定，發(fā)光強(qiáng)度大的各標(biāo)記菌株，參照表3，4點(diǎn)接于含有不同濃度及類型抑菌劑的平板上，進(jìn)行培養(yǎng)并觀察熒光標(biāo)記對(duì)根瘤菌抑菌劑耐受性的影響(表5)。結(jié)果與表3，4比較無(wú)變化，說(shuō)明熒光標(biāo)記并未影響根瘤菌的抑菌劑耐受性。

表5 熒光標(biāo)記根瘤菌的抑菌劑耐受性

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，在根瘤菌的篩選過(guò)程中，各初篩菌株在對(duì)剛果紅吸附狀況、BTB反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、革蘭氏染色等的生理生化反應(yīng)以及對(duì)檸檬酸鹽和蔗糖等碳源的利用情況表現(xiàn)完全一致，符合根瘤菌的代謝特征，但所有初篩菌株可利用可溶性淀粉，不符合根瘤菌的代謝特征，是由環(huán)境影響所致。區(qū)域環(huán)境因素的改變，在影響了宿主植株生長(zhǎng)的同時(shí)也改變了根瘤菌的存活環(huán)境，造成根瘤菌種群和數(shù)量的變化，進(jìn)而導(dǎo)致根瘤菌表型和遺傳型多樣性的改變。這與趙佚麗等[16]對(duì)臺(tái)灣相思根瘤菌的研究結(jié)果一致，即在特定環(huán)境下，根瘤菌的生理生化特性表現(xiàn)出多樣性。所有初篩根瘤菌株在3-酮基乳糖反應(yīng)以及葡萄糖、果糖和乳糖等碳源利用試驗(yàn)中表現(xiàn)出差異性，少數(shù)菌株可在上述指標(biāo)中排除為根瘤菌的可能性。相比較而言，各初篩菌株在無(wú)氮培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度及菌落直徑指標(biāo)最能反映各菌株的活力狀況，該過(guò)程排除根瘤菌可能性的初篩菌株數(shù)目最多。

與各類型及濃度梯度抑菌劑對(duì)空氣和土壤中雜菌的抑制效果相比[7,8]，所有初篩根瘤菌株對(duì)植物源類抑菌劑的相對(duì)耐受效果好，而對(duì)稀土鹽類抑菌劑的耐受效果差，表明植物源類抑菌劑對(duì)試驗(yàn)初篩根瘤菌的選擇毒性低，這與環(huán)境條件所導(dǎo)致的根瘤菌生理生化特性的一致性有關(guān)[17]，即根瘤菌株的抗逆性因其所在地區(qū)環(huán)境的差異而存在差異性[18]。同時(shí)，所有初篩菌株對(duì)抑菌劑的耐受性均類似或優(yōu)于對(duì)照和參比菌株。一方面可能與初篩菌株剛分離自田間植株根瘤，在實(shí)驗(yàn)室中繼代培養(yǎng)的次數(shù)較少，菌株活力維持的較好有關(guān)；另一方面則是由于將所有初篩菌株點(diǎn)接于含抑菌劑平板中，接種量大，促進(jìn)了菌株耐受性的增強(qiáng)。

將熒光標(biāo)記的R.LH3436，S.12531和R.GN5根瘤菌點(diǎn)接于含各濃度梯度及類型抑菌劑的平板中，并觀察其生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)所有標(biāo)記菌的耐受性與原始菌株比無(wú)變化。表明熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)在將發(fā)光基因?qū)敫鼍耐瑫r(shí)，并未對(duì)目標(biāo)根瘤菌造成額外負(fù)擔(dān)，這符合理想的菌株標(biāo)記方法，即檢測(cè)靈敏度高、方法簡(jiǎn)單、成本低廉且標(biāo)記基因?qū)?biāo)記菌不產(chǎn)生負(fù)擔(dān)，可在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定保存等。張淑卿等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，氯化鑭作為外源物質(zhì)時(shí)，對(duì)熒光標(biāo)記根瘤菌的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。而陳力玉等[20]在關(guān)于熒光標(biāo)記根瘤菌和出發(fā)菌株對(duì)寄主植株回接效果的測(cè)試中也發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行了熒光標(biāo)記的根瘤菌對(duì)寄主植株的促生效果與原始菌株比無(wú)差異，這與試驗(yàn)的研究結(jié)果類似，即熒光標(biāo)記根瘤菌的構(gòu)建并不影響原始菌株本身的性質(zhì)，不影響菌株回接對(duì)寄主植株的促生效果或是菌株本身的抑菌劑耐受性，表明使用三親本雜交法構(gòu)建熒光標(biāo)記根瘤菌可以當(dāng)做一種簡(jiǎn)單且檢測(cè)靈敏度高的方法用于菌劑耐受性及回接后植株促生效果的測(cè)試。

參考文獻(xiàn):

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