田晨霞,馬暉玲,張 靜，武新赫

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

草地早熟禾為禾本科草本植物，原產(chǎn)歐洲和亞洲北部，在我國華北、西北、東北地區(qū)以及西南高海拔地區(qū)生長(zhǎng)良好[1,2]。我國北方的草坪草種中，由于草地早熟禾的坪用特性好，廣泛用于各種類型的草坪建植中[3,4]。如今我國草坪建植的面積在逐步增大，而建植草坪所需種子幾乎全靠進(jìn)口。從長(zhǎng)遠(yuǎn)看，培育我國的草地早熟禾系列品種已勢(shì)在必行。

草地早熟禾的生殖方式為兼性無融合生殖，其中以體細(xì)胞無孢子生殖占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，還有孤雌生殖和極少量的二倍體孢子生殖[5]。無融合生殖是指不經(jīng)過雌雄配子融合而產(chǎn)生種子的一種特殊生殖方式，能使基因型的雜合性得以保持，從而可以固定雜種優(yōu)勢(shì)，對(duì)作物育種具有極其重要的意義。無融合生殖具有雙胚珠、雙胚囊、雙胚雙苗或多苗等特點(diǎn)[6,7]，黃群策等[8]報(bào)道，被子植物多胚現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)可以追溯到18世紀(jì)著名的植物學(xué)家Leeuwenhok對(duì)柑桔屬(Citrus)植物種子形態(tài)學(xué)的觀察工作。隨后，越來越多的研究者不斷地在其他植物中觀察到多胚現(xiàn)象和多胚苗現(xiàn)象。被子植物的多胚苗來源于種子中相應(yīng)多胚的發(fā)育，而被子植物的多胚包括真多胚、假多胚和不定胚3種類型。在被子植物的1個(gè)胚珠中包含2個(gè)或2個(gè)以上胚的現(xiàn)象稱之為多胚現(xiàn)象。由一粒多胚種子可以同時(shí)萌發(fā)出兩株或兩株以上的幼苗，這種一籽多首稱之為多胚苗。近半個(gè)世紀(jì)以來，全球主要農(nóng)作物增產(chǎn)潛力在生產(chǎn)上的明顯發(fā)揮主要受益于充分地利用了農(nóng)作物的雜種優(yōu)勢(shì)。在充分證實(shí)植物雜種優(yōu)勢(shì)具有普遍性的同時(shí)越來越多的研究者熱心于通過無融合生殖途徑來固定作物雜種優(yōu)勢(shì)的探索性研究。母錫金等[9]對(duì)草地早熟禾的多胚現(xiàn)象進(jìn)行了研究，得出早熟禾的穎果產(chǎn)生雙胚苗和三胚苗是常見的。并且過去大量的研究結(jié)果表明，在一些被子植物中多胚現(xiàn)象與其無融合生殖現(xiàn)象具有一定的正相關(guān)性[10-12]。

無融合生殖是植物生殖生物學(xué)中的一個(gè)重要方面，對(duì)其的深入研究將有助于闡明植物生殖生物學(xué)中的重大理論問題，對(duì)培育新品種也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[13]。因此，對(duì)草地早熟禾無融合生殖的方式和過程的理解和研究，對(duì)其野生種或生態(tài)型的搜集并對(duì)其多胚現(xiàn)象進(jìn)行研究，對(duì)不同品種草地早熟禾多胚率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

本次研究主要以收集的甘肅定西、隴西、清水、秦州、隴南5個(gè)地區(qū)的野生草地早熟禾種質(zhì)材料和商用草地早熟禾品種“巴潤”為材料，通過種子發(fā)芽試驗(yàn)，比較不同來源種質(zhì)材料草地早熟禾發(fā)芽率及多胚苗發(fā)生率的不同，為進(jìn)一步研究其無融合生殖發(fā)育機(jī)理，選育我國本土的草地早熟禾品種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為2012年8～9月在甘肅省定西，秦州，清水，隴西，定西，隴南5個(gè)地區(qū)采集的野生草地早熟禾和商用品種“巴潤”。 種子經(jīng)人工清選、自然干燥后，放入紙袋室內(nèi)常溫(10～25 ℃)保存。

表1 野生草地早熟禾采集地生境信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)芽試驗(yàn) 種子發(fā)芽試驗(yàn)采用國家規(guī)程鑒定標(biāo)準(zhǔn)(國家標(biāo)準(zhǔn)是種子幼根伸出長(zhǎng)度達(dá)到與種子長(zhǎng)度等長(zhǎng)為正常發(fā)芽)。供試材料每品種各取種子2 000粒，每培養(yǎng)皿100粒種子，每品種重復(fù)20次。15/25 ℃變溫條件下紙上萌發(fā)法測(cè)定種子的萌發(fā)率及發(fā)芽指數(shù)，8 h光照，16 h黑暗。按規(guī)定日期計(jì)算發(fā)芽率(第20 d)，并在種子出芽后統(tǒng)計(jì)出苗率及單苗、雙苗和多苗所占比率，并采用SPSS分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及計(jì)算方法

發(fā)芽率(%)=(n/N)×100%

雙胚苗率(%)=(n1/n)×100%

三胚苗率(%)=(n2/n)×100%

多苗率(%)=(n1+n2)/n×100%

式中：n1為雙胚苗數(shù)，n2為三胚苗數(shù)，n為種子正常發(fā)芽粒數(shù)，N為供試種子總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地域草地早熟禾品種發(fā)芽率的統(tǒng)計(jì)

各供試草地早熟禾材料的發(fā)芽率為48%～68%，其中，以秦州野生草地早熟禾發(fā)芽率最高，其數(shù)值為68%；清水、隴南和“巴潤”次之，分別為61%，60%和60%；定西和隴西發(fā)芽率低于以上4個(gè)品種，分別為50%和48%(表2)。

表2 各種質(zhì)材料草地早熟禾多苗發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)

2.2 不同地域野生草地早熟禾雙胚苗發(fā)生率

各供試品種草地早熟禾雙胚苗7.2%～14.2%，其中，商用品種巴潤雙胚苗率高于野生草地早熟禾，其數(shù)值為14.2%；清水、隴西、定西和秦州次之，分別為12.9%、9.6%、8.9%和8.8%；隴南的雙胚苗率最低，為7.2%(表2)。

2.3 草地早熟禾種質(zhì)材料三胚苗發(fā)生頻率的統(tǒng)計(jì)

各供試種質(zhì)材料草地早熟禾的三胚苗發(fā)生率為0%～0.98%，其中隴西野生草地早熟禾三胚苗率高于其他種質(zhì)材料草地早熟禾，其數(shù)值為0.98%；秦州、清水、巴潤和隴南次之，分別為0.34%、0.28%、0.10%和0；隴南野生草地早熟禾中未發(fā)現(xiàn)三胚苗(表2)。

2.4 草地早熟禾種質(zhì)材料多苗發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)

各供試種質(zhì)材料草地早熟禾的多苗發(fā)生頻率為7.5%～14.5%，其中以商用品種巴潤多苗率最高，其數(shù)值為14.5%；隴西、秦州、清水和定西次之，分別為11.7%、11.6%、10.1%和9.3%；隴南的多苗數(shù)最低，為7.5%(圖1)。

圖1 不同野生種質(zhì)材料草地早熟禾多胚苗數(shù)及發(fā)生率Fig.1 Chart of polyembryony seeding rate in wild Poa pratensis

2.5 草地早熟禾多胚苗類型的劃分

草地早熟禾種子出芽20 d后，對(duì)多胚苗進(jìn)行拍照。不同種質(zhì)材料的草地早熟禾中均出現(xiàn)較多的多胚苗現(xiàn)象，以雙胚苗居多。

從草地早熟禾的幼苗的外部形態(tài)進(jìn)行分類，可將草地早熟禾的苗型分為正常單苗、雙苗和三苗；其中雙苗又分為簇生雙苗、對(duì)生雙苗、間生雙苗3種情況，在雙苗中簇生雙苗發(fā)生頻率最高；其中三苗種子又包括對(duì)生三苗、簇生雙苗，三苗發(fā)生頻率極低，還不到百分之一。按照草地早熟禾種子萌發(fā)多苗的生長(zhǎng)狀況，又可將多苗詳細(xì)劃分為以下幾種類型：

單苗型：種子萌發(fā)出1個(gè)幼小苗(圖2-A)。

雙苗型：種子萌發(fā)出2個(gè)幼小苗。

簇生雙苗型：種子同一個(gè)萌發(fā)孔萌發(fā)出2個(gè)幼小苗(圖2-B-a)。

簇生雙苗同步型：種子同一個(gè)萌發(fā)孔萌發(fā)出2個(gè)大小相當(dāng)?shù)挠仔∶?圖2-B-a1)。

簇生雙苗異步型：種子同一個(gè)萌發(fā)孔萌發(fā)出2個(gè)大小不等的幼小苗(圖2-B-a2)。

對(duì)生雙苗型：種子兩個(gè)相對(duì)的萌發(fā)孔各萌發(fā)出1個(gè)幼小苗。

對(duì)生雙苗同步型：種子兩個(gè)相對(duì)的萌發(fā)孔各萌發(fā)出1個(gè)幼小苗，兩個(gè)幼苗大小相當(dāng)(圖2-B-b1)。

對(duì)生雙苗異步型：種子兩個(gè)相對(duì)的萌發(fā)孔各萌發(fā)出1個(gè)幼小苗，兩個(gè)幼苗大小存在較大差異(圖2-B-b2)。

間生雙苗異步型：種子一端的的萌發(fā)孔和種子的中間部位各生出1個(gè)幼苗，這兩個(gè)幼苗一般一大一小(圖2-B-c)。

三苗型：種子萌發(fā)出3個(gè)幼小苗。

簇生三苗型：種子同一個(gè)萌發(fā)孔萌發(fā)出 3個(gè)幼小苗。

簇生三苗同步型：種子同一個(gè)萌發(fā)孔萌發(fā)出 3個(gè)大小相當(dāng)?shù)挠仔∶?圖2-C-a1)。

簇生三苗異步型：種子同一個(gè)萌發(fā)孔萌發(fā)出 3個(gè)幼小苗，其中1大2小或1小2大(圖2-C-a2)。

對(duì)生三苗異步型：種子的兩個(gè)相對(duì)的萌發(fā)孔一端生出1個(gè)幼小苗，另一端生出2個(gè)幼小苗。

對(duì)生三苗異步型：種子的萌發(fā)孔一端生出 1個(gè)較大的幼苗，另一端生出2個(gè)較小幼苗生長(zhǎng)同步(圖2-C-b1)。

對(duì)生三苗異步型：種子一端的萌發(fā)孔萌發(fā)出 2大小不等的幼苗，另1端生長(zhǎng)出1個(gè)幼苗(圖2-C-b2)。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同草地早熟禾材料的發(fā)芽率及多胚苗率

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同草地早熟禾材料的發(fā)芽率、雙胚苗率、三胚苗率及多苗率之間存在差異。不同草地早熟禾發(fā)芽率在48%～68%，單胚苗率在86%～92%，雙胚苗率在7.5%～14.5%，三胚苗率在0～0.98%。母錫金等[9]對(duì)草地早熟禾的多胚現(xiàn)象的研究表明，單胚苗， 雙胚苗或三胚苗的比率為93.17%、5.57%和1.24%。趙世緒[14]早期在研究早熟禾屬作物多胚現(xiàn)象時(shí)報(bào)道，草地早熟禾屬產(chǎn)生多胚的頻率為8%～12%。但很少有文獻(xiàn)記載野生草地早熟禾多胚苗率，且鮮有文獻(xiàn)對(duì)不同品種草地早熟禾的多胚苗率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3.2 草地早熟禾多胚苗類型

圖2 草地早熟禾多胚苗Fig.2 Poly-embryo seedling of P.pratensis

草地早熟禾的多胚苗因其多胚的來源不同，出苗方式也存在較大差異。劉向東等[15]將水稻的多胚苗途徑歸納為4類10種。王巨媛等[16]曾對(duì)韭菜多胚苗發(fā)生頻率及類型進(jìn)行劃分，與草地早熟禾相似，從外部形態(tài)特征上可將發(fā)芽的草地早熟禾種子分為3種類型，即正常單芽、雙芽和三芽種子；其中雙芽種子又包括對(duì)生雙芽、簇生雙芽、種子中部和萌發(fā)孔各萌發(fā)一個(gè)芽3種情況，在雙芽中以簇生雙芽種子的發(fā)生頻率最高；其中三芽種子又包括對(duì)生三芽、簇生三芽，三芽發(fā)生頻率極低，還不到百分之一。

3.3 多胚現(xiàn)象與無融合生殖的關(guān)系

大量的研究結(jié)果表明，在被子植物中多胚現(xiàn)象與其無融合生殖現(xiàn)象具有一定的正相關(guān)性，因而許多學(xué)者以此為依據(jù)試圖通過在被子植物的種質(zhì)資源中尋找具多胚現(xiàn)象的植物材料，進(jìn)而篩選出一些可能具有無融合生殖特性的基因資源[8]。但是只有特定起源的多胚苗材料在其雜種優(yōu)勢(shì)固定中才具有較大的實(shí)用價(jià)值，因而在評(píng)價(jià)多胚苗材料時(shí)，必須要弄清其胚胎學(xué)特性[17]。Grazi等[18]指出草地早熟禾生殖方式為兼性無融合生殖，其無融合率因品種的不同而異，其值在23%～90%，有性品種中僅有2%的后代植株由合子胚發(fā)育而來。由此證明無融合生殖和多胚現(xiàn)象之間必然存在一定的聯(lián)系。試驗(yàn)對(duì)野生草地早熟禾的多胚苗率及多胚苗類型進(jìn)行了系統(tǒng)分析，試圖為闡明草地早熟禾多胚的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)，從而估價(jià)其應(yīng)用價(jià)值。

3.4 草地早熟禾多胚現(xiàn)象發(fā)生的影響因素

多胚苗的發(fā)生涉及多胚的形成和多胚苗的表現(xiàn)兩大階段，多胚的形成不僅受到遺傳背景的影響，多胚苗的表現(xiàn)又受到外界條件的影響。歸納其發(fā)生的原因，主要為：

3.4.1 基因效應(yīng) 草地早熟禾中多胚現(xiàn)象發(fā)生的原因可能是某種遺傳性狀在特定環(huán)境下基因表達(dá)所致。草草地早熟禾的無融合生殖方式主要以無孢子生殖為主[19]，還有少量的孤雌生殖和二倍體孢子生殖[20,21]。所以在胚形成過程中一籽多苗發(fā)生頻率較高，這些生殖性狀可能是由遺傳基因所控制。

3.4.2 環(huán)境效應(yīng) 多胚苗性狀的發(fā)生和發(fā)生頻率的高低在一定程度上受某些環(huán)境因素的影響。Lakshmanan等[22,23]發(fā)現(xiàn)在柑桔屬植物中，植株的年齡、年產(chǎn)果量、植株的營養(yǎng)狀態(tài)和枝條的著生部位等因素對(duì)其不定胚的發(fā)生類型及數(shù)目有明顯影響。本試驗(yàn)研究的甘肅野生草地早熟禾和商用草地早熟禾“巴潤”，因其生長(zhǎng)環(huán)境的差異，其多胚苗率也存在顯著差異。

3.4.3 其他效應(yīng) 試驗(yàn)觀察到草地早熟禾的各個(gè)材料多胚率在9.3% ～14.5%，但是多胚在種子上生長(zhǎng)的位置各不一樣，其中，在正常位且發(fā)育正常的胚，也有多胚中的額外胚，尤其是那些遠(yuǎn)離正常胚位的是否是由胚囊外體細(xì)胞發(fā)育即無融合生殖所形成的不定胚，還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1] 殷朝珍,王兆龍,葛才林.草地早熟禾無融合生殖及其育種利用研究進(jìn)[J].草原與草坪,2006(1):18-23.

[2] 文金花,馬玉壽,施建軍,等.利用草地早熟禾改建江河源區(qū)“黑土型"退化草地的研究[J].草原與草坪,2006(2):41-44.

[3] 趙桂琴,曹致中.草地早熟禾無融合生殖的細(xì)胞學(xué)鑒定[J].草業(yè)學(xué)報(bào),1997,6(4):64-70.

[4] 邱正強(qiáng),曹玉紅,梁麗,等.青海草地早熟禾坪用性狀的比較研究[J].草原與草坪,2009(5):50-55.

[5] 田晨霞,馬暉玲,張?jiān)伱?草地早熟禾胚胎發(fā)育類型及無融合生殖特征[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(13):2633-2642

[6] Hanna W W,Bashaw E C,Apomixis:Its identification and use in plant breeding[J].Crop Sci,1987,27:1136-1139.

[7] Tang G Y,Schertz K F,Bashaw E C.Apomixis in Sorghumlines and their F1Progenies[J].Botanical Gazette,1980,141(3):294-299.

[8] 黃群策,孫敬三.被子植物多胚苗的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào),1998,15(2):1-7.

[9] 母錫金,王伏雄,梁鐵兵.草地早熟禾的多胚現(xiàn)象[J].植物學(xué)通報(bào),1994(1):68-75.

[10] 周開達(dá).四川無融合生殖水稻(SAR-1)的初步研究[J].中國科學(xué)(B輯),1992(8):156-162.

[11] 吳伯驥,謝明唐,陳毅平,等.水稻雄性不育系C1001中發(fā)現(xiàn)無融合生殖株系的細(xì)胞學(xué)和胚胎學(xué)研究[J].中國科學(xué),1990(10):1049-1052.

[12] 郭學(xué)興,劉剛,曾秀英,等.水稻C1001多胚苗發(fā)生規(guī)律的研究[J].四川師范學(xué)院學(xué)報(bào),1991,12(3):227-229.

[13] 賀鳳麗,馬三梅.植物無融合生殖研究新進(jìn)展[J].生命科學(xué),2009,21(1):139-144.

[14] 趙世緒.作物胚胎學(xué)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1982:189-214.

[15] 劉向東,陳啟鋒,李維明,等.水稻多胚苗的初步研究Ⅲ.來源與頻率[J].福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1993,22(2):148-154.

[16] 王巨媛,翟勝,馮輝.韭菜多胚苗發(fā)生頻率及其類型的劃分[J].種子,2005,24(10):32-35.

[17] 袁良琛.多胚水稻ApⅢ的形態(tài)學(xué)觀察和胚胎學(xué)研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué),2003.

[18] Grazi F,Umaerus M,Akerberg E.Oberservations on the mode of reproduction and the embryology of Poa pratensis[J].Hereditas,1961,47:489-541.

[19] Savidan Y.Transfer of apomixis through wide crosses[M]∥Savidan Y,Carman J G,Dresselhaus T.Mexico:CIMMYT,IRD,European Commissi on DG VI,2001：153-167.

[20] 王風(fēng)翱.作物胚胎學(xué)基礎(chǔ)[M].長(zhǎng)沙:湖南科技出版社,1987.

[21] Marshall D R,Brown A H D.The evolution of apomixis[J].Heredity,1981,47(1):1-15.

[22] Lakshmanan K K,Ambegaokar K B.Embryology in angosperms,1984,445-474.

[23] 許方.園藝植物胚胎學(xué)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1993.