趙 芹，謝大森，彭慶務(wù)，郭巨先，周 念

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東廣州 510640)

利用雙向電泳技術(shù)分離節(jié)瓜葉片總蛋白的方法研究

趙 芹，謝大森，彭慶務(wù)，郭巨先，周 念

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東廣州 510640)

【目的】建立適合節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究的雙向電泳體系.【方法】以節(jié)瓜品種“A37毛節(jié)瓜”為材料，對蛋白質(zhì)抽提方法、上樣量、凝膠濃度及IPG膠條pH范圍等關(guān)鍵因素進(jìn)行探索與優(yōu)化.【結(jié)果和結(jié)論】與TCA/丙酮沉淀法及酚提取法相比，改良酚提取法抽提蛋白質(zhì)總量較高，純度最高，SDS-PAGE電泳條帶明顯、清晰，雙向電泳圖譜蛋白質(zhì)點最多、清晰均勻、縱橫條紋少.利用17 cm pH 4～7范圍IPG膠條、120 μg蛋白質(zhì)上樣量、12%凝膠濃度，硝酸銀染色獲得蛋白質(zhì)點數(shù)豐富、分辨率高、背景清晰且重復(fù)性好的雙向電泳圖譜，檢測到節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)點1 936個，相對分子質(zhì)量主要分布于15 000～100 000之間.初步建立了一套適用于節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究的雙向電泳體系，為后續(xù)開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究及其相關(guān)工作奠定了基礎(chǔ).

節(jié)瓜;葉片總蛋白;蛋白質(zhì)組學(xué);雙向電泳

隨著后基因組時代的到來，蛋白質(zhì)組學(xué)成為功能基因組學(xué)研究的重要支柱及生命科學(xué)研究的熱點和核心.蛋白質(zhì)組學(xué)研究一個基因、一種細(xì)胞組織或生物所表達(dá)全部蛋白的復(fù)合體組成、互作關(guān)系與豐度以及修飾狀態(tài)等［1-2］.雙向電泳技術(shù)(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)可以比較分析在不同條件下生物樣品的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)蛋白，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)和數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出具特定功能的蛋白［3］，因此成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要工具，已廣泛應(yīng)用于擬南芥、水稻等多種植物的遺傳多樣性蛋白質(zhì)組學(xué)、突變體蛋白質(zhì)組學(xué)、生理蛋白質(zhì)組學(xué)和發(fā)育蛋白質(zhì)組學(xué)研究等方面［4-6］.

蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)包括蛋白質(zhì)樣品的制備、等電聚焦與第2向PAGE電泳、凝膠染色、圖像掃描分析等一系列繁雜程序.獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品、清晰的雙向電泳圖譜是開展研究的重要前提.植物組織蛋白因材料種類、取樣部位、取樣時間、生理病理狀態(tài)不同導(dǎo)致組成成分的差異［7］.2-DE試驗中的上樣方式、等電聚焦和染色等各個環(huán)節(jié)均影響蛋白質(zhì)分離效果.因此，對于每一種樣品，為了獲取最佳的電泳結(jié)果，需確定特定的條件組合，建立一套穩(wěn)定的、高分辨率的雙向電泳體系.

節(jié)瓜Benincasa HispidaCogn.var.為我國華南特色蔬菜，其風(fēng)味別致，營養(yǎng)豐富，是供應(yīng)本地市場及廣東出口創(chuàng)匯的主要蔬菜之一［8］.目前節(jié)瓜蛋白質(zhì)組學(xué)研究鮮有報道.為了研究節(jié)瓜抵御脅迫、生長發(fā)育及遺傳改良等方面的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，探索其分子機(jī)制，建立節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)2-DE電泳體系勢在必行.本研究以生菜、萵苣、蘿卜、黃瓜等葉片蛋白質(zhì)的2-DE分離體系為基礎(chǔ)［9-11］，針對節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)抽提方法、上樣量、凝膠濃度及IPG膠條pH范圍等因素進(jìn)行了探討，建立了一套適合節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究的雙向電泳體系，為后續(xù)節(jié)瓜蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料“A37毛節(jié)瓜”種子由廣東省農(nóng)科院蔬菜所保存，播種于m(蛭石)∶m(草炭土)=1∶2的營養(yǎng)盤內(nèi)，溫室培養(yǎng)，待長出2片真葉時，采集第1片真葉，液氮速凍，-80℃保存.

交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)購自BIO BASIC INC公司;胎牛血清標(biāo)準(zhǔn)品BSA購自Sigma公司;17 cm IPG膠條(pH 3～10、4～7)、IPG緩沖液、兩性電解質(zhì)、蛋白酶抑制劑PMSF、2-D Marker、尿素、覆蓋油等購自GE Healthcare公司;硫脲、二硫蘇糖醇(DTT)購自Amresco公司;3-［(3-膽酰胺丙基)二乙胺］丙磺酸(CHAPS)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的丙烯酰胺單體儲液、四甲基乙二胺(TEMED)、碘乙酰胺(IOA)購自Amersham公司;JY96-Ⅱn超聲儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司;ETTAN DAL Tsix垂直電泳槽、ETTAN IPGDHOR 3等電聚焦儀、PROTEANⅡMOLTI-CELL垂直電泳系統(tǒng)、Image Master 2D Platinum 5.0軟件均為GE Healthcare公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 節(jié)瓜葉片總蛋白的提取方法 TCA/丙酮沉淀法：參考Giavlisco等［12］方法略作改進(jìn)，取1.0 g節(jié)瓜葉片液氮速凍并加入0.1 g PVPP研碎，懸浮于預(yù)冷丙酮溶液(含φ為10%的TCA、φ為0.07%的 β-ME)中，-20℃沉淀l h;12 000 r·min-1離心1 min，預(yù)冷丙酮(含φ為0.07% 的β-ME)懸浮沉淀;重復(fù)此步驟2次，徹底去除殘留TCA;沉淀用φ為80%的預(yù)冷丙酮洗滌幾次至顏色發(fā)白，冷凍真空干燥.

酚抽提法：參考 Hurkman等［13］方法并加以改進(jìn)，將節(jié)瓜葉片(1.0 g)研磨后，利用φ為80%的丙酮溶液清洗粉末;加入2.5 mL Tris飽和酚與等體積提取液(0.1 mol·L-1Tris-HCl、pH 8.8、10 mmol·L-1EDTA、φ為0.4% 的β-ME、0.9 mol·L-1蔗糖)渦旋，4℃放置30 min，離心后上層酚相加入5倍體積0.1 mol·L-1醋酸銨-甲醇溶液，-20℃ 1 h，離心沉淀，依次用0.1 mol·L-1醋酸銨-甲醇和預(yù)冷的φ為80%的丙酮溶液各清洗2次，預(yù)冷φ為70%的乙醇溶液清洗1次，冷凍干燥備用.

改良酚抽提法：參考Deng等［14］方法并加以改進(jìn)，1.0 g節(jié)瓜葉片加入0.1 g PVPP研磨，加入10 mL提取液(蔗糖7 mol·L-1、KCl 0.1 mol·L-1、EDTA 50 mmol·L-1、Tris-HCl 0.5 mol·L-1、pH 7.5)及10 mL Tris飽和酚，振蕩后冰浴;4℃ 5 000 r·min-1離心30 min，上層酚相加入等體積提取液，按上述操作重復(fù)2次;得到的酚相加入5倍體積醋酸銨-甲醇溶液，-20℃沉淀過夜;離心后5 mL甲醇溶液洗滌蛋白質(zhì)2次，5 mL丙酮溶液洗滌3次，室溫干燥.

1.2.2 蛋白質(zhì)溶解與定量 提取的蛋白質(zhì)團(tuán)塊中加入200 μL水化液(7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、40 g·L-1的CHAPS、φ為2%的兩性電解質(zhì)載體、60 mmol·L-1DTT)，用槍頭反復(fù)吸吹至充分分散.超聲助溶，80 W，0.8s開、0.8s關(guān)，超聲4次后置于冰上冷卻，重復(fù)1次，4℃、12 000 r·min-1離心20 min，吸出上清液，轉(zhuǎn)移至新EP管中.

采用Bradford蛋白質(zhì)定量法［15］對3種方法提取的總蛋白進(jìn)行定量.每個樣品進(jìn)行3次獨立定量，計算蛋白質(zhì)總產(chǎn)量，再除以每管葉片鮮質(zhì)量求得蛋白質(zhì)提取率，3次定量平均濃度用以計算雙向電泳的蛋白質(zhì)上樣量.利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行不同方法蛋白產(chǎn)量的差異顯著性分析.

1.2.3 單向SDS-PAGE電泳 參考Sambrook等［16］的方法，采用12%分離膠、5%濃縮膠，上樣量分別按5、10 μg進(jìn)行，在ETTAN DALTsix垂直電泳槽上電泳.

1.2.4 雙向電泳 第1向等電聚焦：在 ETTAN IPGPHOR 3等電聚焦儀上完成，樣品水化上樣.IPG膠條膠面朝下放入盛放蛋白質(zhì)樣品(相應(yīng)量蛋白質(zhì)、w為1%的DTT、φ為1%的IPG Buffer、1×溴酚藍(lán)溶液、水化液至460 μL)的水化盤槽中，20℃泡脹過夜(10～12 h).取出膠條放入等電聚焦盤中，搭鹽橋，按照操作手冊《2-D Electrophoresis principle and methods》設(shè)定，并結(jié)合孔芳等［6］報道程序，略作改進(jìn)，操作步驟：300 V 0.5 h，700 V 0.5 h，1 500 V 1.5 h，9 000 V 3 h，9 000 V 4 h.等電聚焦結(jié)束后，放入平衡管中-20℃保存.

平衡：每支平衡管先加8 mL 100 mmol·L-1DTT平衡液平衡15 min，倒除平衡液馬上加入250 mmol·L-1IOA平衡液平衡15 min.

第2向 SDS-PAGE電泳：采用 PROTEAN II MOLTI-CELL垂直電泳系統(tǒng)進(jìn)行分離，按照不同濃度配制凝膠.用低熔點瓊脂糖封住膠面，將膠條壓入玻璃板中緊密接觸膠面，酸性端朝左放置;轉(zhuǎn)至電泳槽開始電泳：2W/凝膠45 min，17W/凝膠.

硝酸銀染色：按GE Healthcare公司雙向電泳操作手冊進(jìn)行，并略有改動.將凝膠先固定2 h以上(φ為40%乙醇溶液，φ為 10%冰醋酸溶液，0.68 g·L-1的無水乙酸鈉溶液)，敏化(φ為30%乙醇溶液，3.2 g·L-1硫代硫酸鈉溶液)60 min，漂洗，w為0.25%的硝酸銀溶液染色60 min，漂洗，著色(25 g·L-1的碳酸鈉溶液，用前加φ為0.02%的甲醛溶液)8 min，EDTA終止液(ω=1.46%)孵育45 min，漂洗.

圖像的采集和分析：顯色凝膠經(jīng)UMAX Powerlook1100掃描儀掃描，參數(shù)設(shè)置為透射掃描模式，256灰階，光學(xué)分辨率為300 dpi，利用Image Master 2D Platinum 5.0軟件得到清晰的Tiff格式圖像，對比度與亮度采用軟件默認(rèn)值，分辨率為600 dpi，再通過Image Master 2D 5.0分析軟件系統(tǒng)，對圖像進(jìn)行背景消減、斑點檢測、匹配和獲取斑點位置坐標(biāo)等分析，參數(shù)設(shè)置為Smooth-2、Min area-5、Saliency-3，具體分析步驟見操作說明.

1.2.5 雙向電泳體系的優(yōu)化 蛋白質(zhì)上樣量、第2向SDS-PAGE凝膠濃度及膠條pH范圍與電泳結(jié)果密切相關(guān).本試驗設(shè)置了3個上樣量梯度(80、120和 150 μg)，分離膠濃度分別設(shè)置為10%、12%;選用17 cm膠條不同pH范圍(3～10、4～7)的IPG膠條;電泳參數(shù)：2W/凝膠45 min，17 W/凝膠.

2 結(jié)果與分析

2.1 3種方法提取的節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)含量的比較

稱取等質(zhì)量節(jié)瓜葉片，3種方法獲得蛋白質(zhì)產(chǎn)量經(jīng)SPSS軟件分析，存在顯著差異.TCA/丙酮沉淀法獲得蛋白質(zhì)含量最少，為0.021 mg·g-1，顯著低于酚抽提法(0.491 mg·g-1)和改良酚提取法(0.399 mg·g-1)，裂解液溶解時不易分散.酚抽提法蛋白質(zhì)沉淀最多，略帶黃色，較易分散溶解，改良酚提取法所得蛋白質(zhì)(0.399 mg·g-1)沉淀較多，顏色亮白，易溶于裂解液，蛋白質(zhì)產(chǎn)量與酚抽提法(0.491 mg·g-1)差異顯著，可能由于改良方法樣品處理步驟增多導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)率減少.

2.2 不同提取方法的蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜比較

由圖1可知，3種方法提取的蛋白質(zhì)經(jīng) SDSPAGE分離后，條帶數(shù)目、位置以及染色深淺均存在較大差異.其中，TCA-丙酮沉淀法蛋白質(zhì)條帶(10條左右)明顯少于酚抽提法和改良酚提取法，條帶位置也略低，條帶染色較淺，說明節(jié)瓜葉片中多糖類物質(zhì)嚴(yán)重干擾了蛋白質(zhì)的有效沉淀;酚提取法與改良酚提取法蛋白質(zhì)條帶均很多，帶形明顯、清晰，條帶分離效果好，未見明顯的蛋白質(zhì)降解現(xiàn)象，但改良酚提取法的蛋白質(zhì)條帶又稍多于酚提取法(圖1).由此表明不同制備方法提取的蛋白質(zhì)種類和含量有所不同，以改良酚抽提法為優(yōu)，初步符合2-DE凝膠電泳要求.

圖1 樣品3種方法提取的節(jié)瓜葉片蛋白SDS-PAGE分離結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE pattern of chieh-qua leaves proteins extracted by three sample preparation methods

2.3 不同提取方法對雙向電泳分離效果影響

圖2為對3種方法提取蛋白質(zhì)樣品2-DE分離和銀染后的結(jié)果.結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)點主要集中在pH 4～7和相對分子質(zhì)量15 000～100 000之間，TCA/丙酮沉淀法得到蛋白質(zhì)點極少，且存在明顯豎條紋(圖2A);酚抽提法蛋白質(zhì)點數(shù)量增多，但總數(shù)依然偏少，部分蛋白質(zhì)點融合在一起未能完全分離開，存在橫向條紋干擾(圖2B);改良酚提取法蛋白質(zhì)點顯著增多，多數(shù)近圓形，分布均勻，背景較淺，基本沒有條紋干擾，圖譜質(zhì)量最佳(圖2C).TCA/丙酮沉淀法、酚提取法和改良酚抽提法3種方法的蛋白質(zhì)點數(shù)差異較大，分別為243、1 308和1 596個，經(jīng)SPSS軟件差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，TCA/丙酮沉淀法與酚提取法蛋白質(zhì)點數(shù)差異顯著(P=0.020)，與改良酚抽提法差異顯著(P=0.010)，而酚提取法與改良酚抽提法之間差異不顯著(P=0.227).3種方法在不同相對分子質(zhì)量(Mr)、等電點(pI)范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)種類、含量及分離效果方面均有一定差異.如圖3A所示，在pI 4～7區(qū)域改良酚抽提法(1 207個)蛋白質(zhì)點數(shù)比酚提取法(879個)多328個，比TCA/丙酮沉淀法(160個)多1 047個，在pI 3～4區(qū)域蛋白質(zhì)點數(shù)顯著低于pI 6～7(P=0.021)與pI 7～10區(qū)域(P= 0.012)，而其他區(qū)域間差異不明顯;在中低相對分子質(zhì)量區(qū)(15 000～100 000)，改良酚抽提法(1 414個)效果總體也優(yōu)于酚提取法(1 095個)和TCA/丙酮沉淀法(164個)，分別多319個與1 250個，且蛋白質(zhì)點清晰，縱橫條紋較少，TCA/丙酮沉淀法與酚提取法在該區(qū)蛋白質(zhì)點數(shù)分布差異顯著(P=0.012)，與改良酚抽提法相比呈極顯著差異(P=0.004)，而酚提取法與改良酚抽提法之間差異不顯著(P=0.502);蛋白相對分子質(zhì)量15 000～35 000與100 000～170 000區(qū)域蛋白點數(shù)差異極顯著(P=0.005)，55 000～100 000區(qū)域、15 000～35 000(P=0.015)和35 000～55 000區(qū)域(P=0.04)均差異顯著(圖3B).

圖2 樣品3種方法提取的節(jié)瓜葉片蛋白2-DE分離結(jié)果Fig.2 2-DE isolation of chieh-qua leaves proteins extracted by three sample preparation methods

圖3 樣品不同方法提取蛋白質(zhì)的等電點和相對分子質(zhì)量分布Fig.3 The distribution of proteins spots according to molecular mass(Mr)and isoelectric point(pI)of different protein extraction methods

由此可見，樣品的不同處理方法對同一材料的提取效果是不同的，TCA-丙酮沉淀法受到酚類與多糖類等物質(zhì)的干擾，蛋白質(zhì)丟失現(xiàn)象很嚴(yán)重;與酚提取法相比，改良酚抽提法所提取總蛋白完整性提高，蛋白質(zhì)點丟失減少，較好的消除了微量酚類、多糖類等物質(zhì)殘留造成的背景較深與橫豎條紋，因此改良酚提取法為節(jié)瓜葉片雙向電泳樣品制備的最優(yōu)方法.

2.4 不同上樣量雙向電泳分離結(jié)果比較

3種上樣量比較分析發(fā)現(xiàn)，上樣量為80 μg時，雖然背景較清晰，蛋白點無拖尾現(xiàn)象，但數(shù)量明顯減少(817個)，低豐度蛋白檢出量很少(圖4A);上樣量為120 μg時，蛋白點均勻分布，形態(tài)規(guī)則，呈現(xiàn)較多的低豐度蛋白，無擴(kuò)散和拖尾現(xiàn)象，橫豎條紋干擾少，檢測蛋白點約1 596個(圖4B);上樣量提高至150 μg時，所獲蛋白點約1 527個(圖4C)，數(shù)量不但沒有增加，反而使高豐度蛋白斑點過大，造成交叉重疊，影響其他蛋白點的分離與分析，且橫縱向條紋明顯增加，背景顏色加深，這是由于上樣量過大使樣品溶液中的雜質(zhì)及離子含量增大，聚焦效果差，影響蛋白點的有效分離.因此，綜合考慮圖譜分辨率和蛋白點數(shù)量，最佳上樣量為120 μg.

2.5 第2向凝膠濃度對雙向電泳圖譜的影響

雙向電泳效果取決于蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量范圍，第2向凝膠濃度對蛋白質(zhì)點分布起重要作用.本研究探討10%與12%凝膠濃度對節(jié)瓜蛋白質(zhì)的分離效果，結(jié)果顯示，10%聚丙烯酰胺凝膠中(圖5A)，節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)點分布較靠近溴酚藍(lán)前沿，部分低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)已丟失，圖譜中上部蛋白質(zhì)點分布較少(1 069個);12%凝膠中(圖5B)，蛋白質(zhì)點充分分開(1 596個)，蛋白質(zhì)點清晰，是適于節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)分離的較優(yōu)凝膠濃度.

圖4 不同節(jié)瓜葉片蛋白上樣量2-DE效果比較Fig.4 Comparison of 2-DE maps among different loading quantities of chieh-qua leaves protein

圖5 不同聚丙烯酰胺膠濃度對雙向電泳圖譜的影響Fig.5 2-DE gel maps of protein using different polyacrylamide gel concentrations

2.6 IPG膠條pH范圍的選擇

等電聚焦效果與膠條的長度及pH范圍等因素密切相關(guān).當(dāng)選用pH 3～10濃度梯度IPG膠條時，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)點集中分布在pH 4～7區(qū)域，未完全分開，且低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)分布較少(圖6A).而選用pH 4～7膠條時，雖然損失了部分堿性端蛋白質(zhì)點，卻保留了中性偏酸區(qū)域的大部分蛋白質(zhì)點，蛋白質(zhì)點充分分離，蛋白質(zhì)點近圓形，數(shù)量較多，檢測到1 936個蛋白質(zhì)點(圖6B).這表明：在保證試驗條件一致的情況下，pH 4～7的膠條能顯著提高節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)的分離效果.

圖6 不同pH梯度IPG膠條的雙向電泳圖譜Fig.6 2-DE gel maps of protein using IPG strips with two different pH ranges

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)樣品制備是雙向電泳的首要環(huán)節(jié).理想的樣品制備，應(yīng)盡可能提高蛋白質(zhì)樣品的溶解性，降低蛋白質(zhì)的損耗與降解，在蛋白質(zhì)提取、裂解液配制、雜質(zhì)去除等方面應(yīng)盡量采取步驟簡單的方法［17］.節(jié)瓜葉片富含色素、多糖、酚類、醌類等對雙向電泳干擾嚴(yán)重的次生物質(zhì)，本研究以TCA/丙酮沉淀法、酚抽提法為基礎(chǔ)，加以探索與改良，建立一套適合節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)的制備體系.TCA/丙酮沉淀法能夠有效沉淀蛋白質(zhì)，去除鹽離子和雜質(zhì)提取的蛋白質(zhì)難溶解，小分子蛋白質(zhì)易丟失，在一些蛋白質(zhì)含量低且次生代謝產(chǎn)物豐富的植物樣本中應(yīng)用受到限制［18］，本研究中該方法沉淀蛋白質(zhì)受到節(jié)瓜次生物質(zhì)的嚴(yán)重干擾，蛋白質(zhì)產(chǎn)率低，可溶性差，獲得的SDS-PAGE與2-DE圖譜均不合要求.酚抽提法在去除干擾物質(zhì)方面有一定優(yōu)勢［19］，節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)產(chǎn)率、純度與圖譜質(zhì)量比TCA/丙酮法明顯改善.改良酚提取法首先通過添加PVPP去除色素與多酚，提取液成分的改良有利于更好地去除干擾雜質(zhì)，利用醋酸銨甲醇溶液清洗樣品，進(jìn)一步去除殘留的多酚、油脂和類油脂聚合物等干擾物質(zhì)，增加蛋白質(zhì)沉淀干燥前的甲醇丙酮洗滌次數(shù)，在離心時加大轉(zhuǎn)速和延長離心時間，盡可能徹底去除殘留的雜質(zhì)和鹽離子等干擾物，以減少雙向電泳中的條紋干擾，但增加制備步驟使蛋白質(zhì)含量略減少，該法處理所得2-DE圖譜顯著改善，顯示出更多蛋白質(zhì)點，獲得較高蛋白質(zhì)產(chǎn)量.

IPG膠條選擇需根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)分布、目的蛋白質(zhì)性質(zhì)及豐度等進(jìn)行選擇.對于未知蛋白質(zhì)分布特性的樣品，可以先用寬pH梯度IPG膠條進(jìn)行分離，可清晰地縱覽總蛋白的分布，進(jìn)而選用窄pH梯度IPG膠條，分離等電點相差不大的蛋白質(zhì)，顯著提高分辨率.對于蛋白質(zhì)點無法充分分離的pH區(qū)域，可選用對應(yīng)范圍的窄pH梯度的IPG膠條進(jìn)一步進(jìn)行分離.本研究表明，pH 4～7 IPG膠條比pH 3～10 IPG膠條得到的蛋白質(zhì)信息量更大.pH范圍寬的IPG膠條能反應(yīng)節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)的特征，但難以有效區(qū)分等電點接近的蛋白質(zhì)，在pH 4～7分離出大量蛋白質(zhì)，說明節(jié)瓜葉片的功能性蛋白主要分布在該區(qū)域.

雙向電泳最佳上樣量受多種因素的影響，如上樣方式、IPG膠條長度和pH范圍、染色方法等［20］，窄pH梯度IPG膠條比寬pH梯度IPG膠條需更大上樣量，杯上樣相對于水化上樣，上樣量可以減少，考染比銀染需要更大上樣量.因此最佳上樣量必須通過實踐經(jīng)驗決定.雙向電泳一般推薦的上樣量不超過1.2 mg，不低于50 μg.提高蛋白質(zhì)上樣量，有利于低豐度蛋白質(zhì)檢測，但上樣量過高可導(dǎo)致高豐度蛋白質(zhì)斑點掩蓋低豐度蛋白質(zhì)，且鹽離子濃度過高可直接影響到等電聚焦效果，產(chǎn)生橫向干擾.上樣量較低，蛋白點分離較好，圖譜清晰，但也會導(dǎo)致低豐度蛋白質(zhì)微弱或丟失.另外綠色葉片中含有大量Rubisco酶(w可達(dá)50%)［21］，故需適當(dāng)提高上樣量利于低豐度蛋白質(zhì)檢測.基于上述因素，本研究選用120 μg為最佳上樣量，此時蛋白質(zhì)點清晰，無橫條紋干擾，圖譜質(zhì)量最佳.

雙向電泳中第2向SDS-PAGE中凝膠濃度，對于蛋白質(zhì)點分布起到重要作用.凝膠濃度太大導(dǎo)致大分子量蛋白質(zhì)聚集在凝膠上部，不能得到很好分離，而凝膠濃度太小又會使小分子量蛋白質(zhì)聚集在溴酚藍(lán)前沿，所以選擇適當(dāng)濃度的凝膠才能得到蛋白質(zhì)點分布均勻的理想圖譜.使用10%濃度凝膠時，大多數(shù)蛋白質(zhì)集中在凝膠中下部區(qū)域，部分蛋白質(zhì)點丟失，且蛋白質(zhì)點不夠清晰.稍微提高凝膠濃度至12%，蛋白質(zhì)點富集區(qū)域的分辨效果得到改善，而且低分子量蛋白未超出凝膠所能容納的范圍.

綜上所述，本研究通過節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)提取方法、上樣量、膠條pH范圍和PAGE凝膠濃度的優(yōu)化，建立了一套重復(fù)性好、分辨率高的節(jié)瓜葉片蛋白質(zhì)雙向電泳體系，即采用改良酚提取法抽提制備蛋白質(zhì)樣品，17 cm、pH 4～7膠條等電聚焦、120 μg上樣量、12%第2向凝膠濃度進(jìn)行雙向電泳分析，硝酸銀染色，可獲得質(zhì)量較高的雙向電泳圖譜.

另外，由于節(jié)瓜葉片含有大量葉綠體及很多與光合作用有關(guān)的Rubisco羧化酶/加氧酶等高豐度蛋白，低豐度調(diào)控蛋白受到了高豐度蛋白的覆蓋和遮蔽，去除Rubisco高豐度蛋白對于更科學(xué)而精確地利用雙向電泳研究節(jié)瓜蛋白質(zhì)組學(xué)是必要的.在后續(xù)的研究中，將嘗試PEG分步沉淀法［6］和Mg/NP-40/PEG3350/ TCA/丙酮提取法［5］有效剔除節(jié)瓜葉片中高豐度的Rubisco結(jié)構(gòu)蛋白，提高低豐度蛋白可檢測性，使節(jié)瓜蛋白雙向電泳圖譜的飽和度與分辨率進(jìn)一步提高.

［1］ WILKINS M R，WILLIAMS K L，APPEL R D，et al.From proteins proteomes：Large scale protein identification by two dimensional electrophorese and amino acid analysis［J］.Biotechnology，1996，14：61-65.

［2］ DU H K.Gel-based proteomics approach for detecting low nitrogen-responsive proteins in cultivated rice species［J］.Physiol Mol Biol Plants，2009，15(1)：31-41.

［3］ 甘露，李殿榮，臧新，等.甘藍(lán)型油菜蛋白雙向電泳體系的建立［J］.作物學(xué)報，2010，36(4)：612-619.

［4］ RUTSCHOW H，YTTERBERG A J，F(xiàn)RISO G，et al.Quantitative proteomics of a chloroplast SRP54 sorting mutant and its genetic interactions with CLPC1 inArabdopsis［J］.Plant Physiol，2008，148：156-175.

［5］ 鐘俐，馬成梅，梁永增，等.甜瓜葉片中Rubisco的去除及雙向電泳體系的優(yōu)化［J］.植物生理學(xué)報，2012，48 (3)：303-309.

［6］ 孔芳，蔣金金，吳磊，等.油菜葉片總蛋白雙向電泳樣品制備方法的改進(jìn)［J］.生物技術(shù)通報，2010，5：93-110.

［7］ ISLAM N，LONSDALE M，UPADHYAYA N M，et al.Protein extraction from mature rice leaves for two-dimensional gel electrophoresis and its application in proteome analysis［J］.Proteomics，2004(4)：1903-1908.

［8］ 謝大森，何曉明，彭慶務(wù)，等.瓜類枯萎病發(fā)生機(jī)理研究進(jìn)展［J］.仲愷農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2006，19(3)：65-70.

［9］ 劉麗娟，舒烈波，陳海榮，等.適用于生菜葉片質(zhì)雙向電泳方法的建立及初步應(yīng)用［J］.植物遺傳資源學(xué)報，2009，10(1)：106-110.

［10］陳曙紅，韓瑩琰，范雙喜，等.葉用萵苣葉片總蛋白質(zhì)雙向電泳影響因素的研究［J］.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2012，27(2)：14-16

［11］范海延，陳捷，張春宇，等.適于黃瓜葉片蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳方法最佳條件的研究［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，39(3)：365-367.

［12］GIAVALSCO P，NOPDHOFF E，LEHRACH H，et al.Extraction of proteins from plant tissues for two-dimensional electrophoresis analysis［J］.Electrophoresis，2003，24 (1/2)：207-216.

［13］HURKMAN W J，TANAKA C K.Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis［J］.Plant Physiol，1986，81：802-806.

［14］DENG Z P，ZHANG X，TANG W Q，et al.A proteomics study of brassino-steroid response inArabidopsis［J］.Mol Cell Proteomics，2007，6：2058-2071.

［15］BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72(1/2)：248-254.

［16］SAMBROOK J，F(xiàn)RITSCH E F，MANIATIS T.Molecular cloning：A laboratory manual［M］.3rded.Beijing：Science Press，2002.

［17］JELLOULI N，SALEM A B，GHORBEL A，et al.Evaluation of protein extraction methods forVitis viniferaleaf and root proteome analysis by two-dimensional electrophoresis［J］.J Integr Plant Biol，2010，52(10)：933-940.

［18］WANG W，VIGNANI R，SCALI M，et al.A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis［J］.Electrophoresis，2006，27(13)：2782-2786.

［19］WANG W，SCALI M，VIGNANI R，et al.Protein extraction for two-dimensional electrophoresis from olive leaf，a plant tissue containing high levels of interfering compounds［J］.Electrophoresis，2003，24(14)：2369-2370.

［20］LIN Jinke，ZHEN Jingui，YUAN Ming，et al.The improvement of isolation and the method of two-dimensional electrophoresis of protein from tea plant［J］.J Tea Sci，2003，23(1)：16-20.

［21］ELLIS R J.The most abundant protein in the world［J］.Trends Biochem Sci，1979，4：241-244.

【責(zé)任編輯 霍 歡】

An optimization study on two-dimensional electrophoresis for chieh-qua leaf proteomic analysis

ZHAO Qin，XIE Dasen，PENG Qingwu，GUO Juxian，ZHOU Nian
(Vegetable Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China)

【Objective】To establish two-dimensional electrophoresis(2-DE)system suitable for chieh-qua leaf proteomics analysis.【Method】The effects of various protein extraction methods of 2-DE were intercompared using the leaves of“A37maojiegua”as the materials，and the loading quantity of sample，SDSPAGE gel concentration and the pH range of IPG strips were also investigated and optimized.【Result and conclusion】The results showed that modified phenol extraction method was notably superior to TCA/acetone precipitation method and phenol extraction method in total protein quality and clarity of protein bands in SDS-PAGE electrophoresis，and the final 2-DE image map based on modified phenol extraction method had the maxium protein dots and clear background，slight streaking，more completely separated spots compared with the other methods.The further optimization of 2-DE system was carried out to obtain a 2-DE electrophoretogram abundant protein spots，high resolution，clear background and excellent repeatability with 17 cm IPG strips，120 μg protein loading quantity，SDS-PAGE with 12%gel concentration and IPG strips with pH 4-7，finally detecting proteins with modified silver nitrate staining.More than 1 936 protein spots were detected and their relative molecular mass ranged from 15 000 to 100 000.The optimization of the experimental conditions of 2-DE system suitable for chieh-qua proteomics research has been constructed，which provides a basis for further investigation of chieh-qua proteomics researches.

chieh-qua;total protein of leaf;proteomics;two-dimensional electrophoresis

S336

A

1001-411X(2014)03-0079-07

2013-07-10 優(yōu)先出版時間：2014-03-31

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/doi/10.7671/j.issn.1001-411X.2014.03.015.html

趙 芹(1982—)，女，副研究員，博士，E-mail:zhaoqin0802@126.com

廣東省自然科學(xué)基金博士啟動基金(10451064001006063);廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金(1279009475432)

趙 芹，謝大森，彭慶務(wù)，等.利用雙向電泳技術(shù)分離節(jié)瓜葉片總蛋白的方法研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，35(3)：79-85.