李 里 吳玉斌

(遼寧醫(yī)學(xué)院兒科，遼寧 錦州 121001)

PAX2基因編碼核轉(zhuǎn)錄因子，是腎臟胚胎發(fā)育過(guò)程中誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵性發(fā)育基因之一〔1〕，成熟腎單位其表達(dá)減少。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，PAX2在病理腎中出現(xiàn)胎兒期的回歸表達(dá)，參與腎臟的損傷過(guò)程，其具體機(jī)制尚不明確。慢病毒載體是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型病毒載體，其介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi)相對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)的RNAi而言，其感染的細(xì)胞種類(lèi)更廣，基因沉默的效果更好，轉(zhuǎn)染效率更高，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，因而被廣泛用于基因表達(dá)調(diào)控、基因治療等領(lǐng)域。本研究設(shè)計(jì)、構(gòu)建和鑒定表達(dá)PAX2 siRNA 的慢病毒載體，為研究PAX2基因調(diào)控腎間質(zhì)纖維化腎管坡細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)機(jī)制及基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 人胚腎293T細(xì)胞、大腸桿菌菌株DH5α，pGCSIL-GFP載體、pHelper1.0 載體、pHelper 2.0 載體小干擾序列和引物(上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒和慢病毒包裝試劑盒(均德國(guó)QIAGEN公司)；轉(zhuǎn)染試劑positive clone germ測(cè)序、DNA ladder Marker(美國(guó) Invitrogen 公司)；大鼠正常腎小管上皮細(xì)胞(NRK52E)(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞所)；瓊脂糖和SDS(美國(guó)Sigma公司)； 優(yōu)質(zhì)胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；PAX2單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(中杉金橋公司)。

1.2方法

1.2.1RNA干擾PAX2慢病毒載體制備 根據(jù)靶序列篩選原則，采用本課題前期研究成果中的靶點(diǎn)序列GGAGCGAGTTCTCAGGCAA，據(jù)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)互補(bǔ)的單鏈DNA(中間有l(wèi)oop環(huán))，兩端為限制性?xún)?nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的粘性末端(表1)。AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切pGCSIL-GFP載體使其線(xiàn)性化。把合成后成對(duì)的引物干粉溶解于退火緩沖液中，90 ℃水浴15 min，然后自然冷卻至室溫，形成帶雙鏈的DNA oligo。按如下體系連接至載體：線(xiàn)性化的載體DNA 1 μl，DNA oligo 1 μl，10×連接緩沖液 2 μl，T4連接酶1 μl，ddH2O補(bǔ)足至20 μl，混勻后16 ℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞， 經(jīng)菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆菌株送測(cè)序。

表1 PAX2-shRNA 的結(jié)構(gòu)框架

1.2.2慢病毒包裝、濃縮及滴度檢測(cè) 提取慢病毒包裝系統(tǒng)中質(zhì)粒DNA，及兩種輔助包裝元件載體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染前24 h，調(diào)整293T細(xì)胞密度為1.2×107個(gè)/20 ml，接種于培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。將質(zhì)粒DNA與(Opti-MEM)混合均勻，調(diào)整總體積為2.5 ml，室溫下溫育5 min；稀釋后的質(zhì)粒與稀釋后的Lipofectamine 2000進(jìn)行混合，室溫下溫育5 min；將混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染后8 h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液。病毒濃縮純化使用Centricon Plus-20離心超濾裝置(USA)，對(duì)其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，分裝后保存在病毒管中，-80℃長(zhǎng)期保存。取其中一支使用逐孔稀釋滴度測(cè)定法進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測(cè)定，并計(jì)算病毒滴度。

1.2.3NRK52E的培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染 NRK52E細(xì)胞在含10%胎牛血清，95% 濕度，5% CO2， RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，37℃。轉(zhuǎn)染前，常規(guī)消化收集細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為50%～70%時(shí)，用慢病毒液感染NRK52E細(xì)胞，6～8 h后換液，感染48 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞強(qiáng)化綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況。

1.2.4RT- PCR檢測(cè)感染細(xì)胞PAX2基因的mRNA表達(dá) 取感染效率在 80%以上的靶細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA， 以未感染和感染空載體細(xì)胞為對(duì)照。 分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度，取等量RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA， 以cDNA 為模板用RT- PCR 法檢測(cè)PAX2 mRNA表達(dá)量。PAX2及β-actin引物由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成，PAX2 F5′-CGGTGAGAAGAGGAAACGAG-3′，R5′-GCTTGGAAGACATCGGGATA-3′；片段長(zhǎng)度246 bp；β-actin引物序列：F5′-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3；R5′-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3；片段長(zhǎng)度498 bp。擴(kuò)增條件為：94℃ 1 min，58 ℃ 50 s，72 ℃ 1.5 min，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。1.0%質(zhì)量分?jǐn)?shù)瓊脂糖凝膠電泳,100 v,約20 min,電泳后0.5 mg/L，EB染色45 min,凝膠成像系統(tǒng)掃描每個(gè)目的條帶的紫外光光密度。計(jì)算每個(gè)標(biāo)本擴(kuò)增的目的條帶與相應(yīng)β-actin條帶的吸光度比值(R),代表該樣本細(xì)胞目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5Western 印跡檢測(cè)感染細(xì)胞PAX2蛋白的表達(dá) 取感染后的靶細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，離心沉淀后作超聲破碎處理，并使蛋白變性；SDS-PAGE凝膠電泳樣品;電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)移電泳裝置，在4℃，400 mA恒流條件下電轉(zhuǎn)120 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到(PVDF)膜上;用封閉液〔含5%脫脂牛奶的(TBST)溶液〕室溫封閉PVDF膜1 h或4℃過(guò)夜。用封閉液稀釋的一抗抗體與封閉好的PVDF膜室溫孵育2 h或4 ℃過(guò)夜；TBST洗膜3次，每次10 min；在室溫下，用封閉液稀釋的二抗與PVDF膜孵育2 h；TBST洗膜3次，每次10 min；采用Amersham公司ECL+plusTM，Western 印跡 system試劑盒進(jìn)行顯色；在暗房中進(jìn)行獲得顯示條帶的膠片。用GAPDH作內(nèi)參照驗(yàn)證蛋白的含量。計(jì)算每個(gè)標(biāo)本的目的條帶與相應(yīng)內(nèi)參照基因β-actin條帶的光密度比值(R),代表該樣本細(xì)胞目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1鑒定與測(cè)序結(jié)果 陽(yáng)性克隆的鑒定PAX2基因的寡核苷酸序列，經(jīng)退火形成雙鏈，與經(jīng)AgeⅠ和 EcoR I雙酶切后的pGCSIL-GFP載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑選重組陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定和測(cè)序。PAX2基因干擾的重組細(xì)菌克隆產(chǎn)物362 bp(插入片段為56 bp)經(jīng)雙酶切后沒(méi)有插入片段的pGCSIL-GFP載體產(chǎn)物306 bp為對(duì)照，鑒定結(jié)果和預(yù)期一致(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，合成的PAX2-shRNA核苷酸序列插入正確，中間為產(chǎn)生針對(duì)靶基因的寡核苷酸(圖2)。

M：DL 2000 DNA marker；1：PAX2基因干擾的重組細(xì)菌克隆產(chǎn)物；2：經(jīng)雙酶切后沒(méi)有插入片段的pGCSIL-GFP載體產(chǎn)物

2.2RNAi慢病毒大量包裝 將重組慢病毒載體pGCSIL-GFP- PAX2、慢病毒包裝質(zhì)粒pHelper 1.0 載體、Helper 2.0載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后的綠色熒光強(qiáng)度高，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，表明病毒包裝成功(圖 3)。病毒過(guò)濾濃縮后測(cè)定病毒滴度為2×108TU/ml，滴度高符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.3慢病毒轉(zhuǎn)染NRK52E 細(xì)胞的效果 用慢病毒上清感染NRK52E細(xì)胞， 感染后48 h熒光顯微鏡觀察GFP熒光情況，見(jiàn)細(xì)胞熒光明顯，感染效率為81.2%(圖 4)。

圖2 PAX2-shRNA測(cè)序結(jié)果

圖3 慢病毒包裝后293T細(xì)胞熒光表達(dá)情況(×100)

圖4 慢病毒感染NRK52E細(xì)胞后熒光表達(dá)情況(×200)

M：DL 2000 DNA marker ;1～3：β-actin;4：未轉(zhuǎn)染組;5：空載組;6：慢病毒感染組

2.4慢病毒轉(zhuǎn)染NRK52E 細(xì)胞后PAX2 mRNA和蛋白的表達(dá) 感染PAX2 shRNA慢病毒的細(xì)胞組與對(duì)照組及空載組相比較，PAX2基因的mRNA表達(dá)水平有明顯下降，敲減率為46%(圖5，表2)(P<0.05)。感染PAX2 shRNA慢病毒的細(xì)胞組與對(duì)照組及空載組相比較，PAX2蛋白表達(dá)水平有明顯下降，敲減率為45%(圖6，表2)(P<0.05)。

表2 慢病毒轉(zhuǎn)染后對(duì)PAX2基因表達(dá)量的影響

圖6 慢病毒介導(dǎo)的PAX2 RNAi對(duì)NRK52E細(xì)胞PAX2蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

梗阻性腎病的發(fā)病率逐年升高，兒童梗阻性腎病占兒童終末期腎臟疾病的0.3%，占兒童腎移植的16.1%〔2〕。腎間質(zhì)纖維化是梗阻性腎病最終的共同途徑，是慢性腎衰竭的進(jìn)行性發(fā)展過(guò)程中的始動(dòng)因素。EMT它是腎間質(zhì)纖維化的重要發(fā)病機(jī)制之一〔3，4〕。PAX2基因編碼核轉(zhuǎn)錄因子，是腎臟胚胎發(fā)育過(guò)程中誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵性發(fā)育基因之一，在前、中、后腎發(fā)育的全過(guò)程中表達(dá)。Li等〔5〕研究表明：PAX2在梗阻性腎病大鼠模型腎臟中出現(xiàn)了回歸表達(dá)，且參與調(diào)控EMT，但對(duì)其作用機(jī)制仍然不清楚。

RNAi現(xiàn)象是指內(nèi)源性或外源性雙鏈 RNA(dsRNA)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失，屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默機(jī)制。隨著對(duì)RNA：現(xiàn)象機(jī)制的深入研究，RNAi已經(jīng)成為一種功能基因組研究的有效工具，在基因治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值正引起臨床的廣泛關(guān)注〔6〕。慢病毒載體是一種復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，以H型免疫缺陷病毒(HIV1)為基礎(chǔ)發(fā)展而得，能夠轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞和分裂期細(xì)胞，而且病毒的遺傳物質(zhì)能夠整合到宿主的基因組，將其用于梗阻性腎病的基因治療，除比其他病毒載體更具優(yōu)勢(shì)外，病毒的糖蛋白(VSVG)外殼使載體病毒顆粒具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性，慢病毒載體RNAi作用持久，同時(shí)擴(kuò)大了載體感染細(xì)胞的范圍，因此慢病毒載體是很有前途的基因治療載體。用慢病毒載體介導(dǎo) RNAi的幾項(xiàng)研究〔7，8〕均顯示了該技術(shù)策略在內(nèi)源性基因功能研究和基因治療前沿領(lǐng)域的重大意義。

根據(jù)本課題前期研究成果中的靶點(diǎn)序列與pGCSIL-GFP載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的序列一致，成功構(gòu)建siRNA-PAX2慢病毒載體，經(jīng)293T細(xì)胞包裝以后產(chǎn)生慢病毒，體外感染NRK52E細(xì)胞后能有效降低PAX2mRNA和蛋白的表達(dá)， 提示可以通過(guò)PAX2特異性RNAi來(lái)研究其在梗阻性腎病發(fā)生、發(fā)展中的作用，進(jìn)一步揭示腎臟纖維化的機(jī)制，為后續(xù)以PAX2為靶點(diǎn)的基因治療梗阻性腎病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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