呂冬霞 杜 偉 范曉艷 王曉麗 李 玉

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

灰樹花多糖(PGF)是從優(yōu)質(zhì)灰樹花子實(shí)體中提取的有效活性成分，研究表明PGF具有抗腫瘤作用〔1，2〕。本研究采用免疫組化法檢測半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3，Caspase-8，細(xì)胞色素C(Cytc)在PGF聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)H22腫瘤細(xì)胞凋亡過程中的變化，觀察PGF聯(lián)合順鉑對腫瘤生長的影響，探討其抑瘤作用機(jī)制和細(xì)胞凋亡通路。

1 材料與方法

1.1材料 瘤株：H22肝癌細(xì)胞購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院動物中心；實(shí)驗(yàn)動物：昆明種近交系雄性小鼠，體重(20±2.0)g，佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：黑動字第99101001，普通級，普通環(huán)境飼養(yǎng)。PGF粉末：浙江方格藥業(yè)有限公司，多糖含量為90%。順鉑粉劑：山東齊魯制藥廠。Caspase-3，Caspase-8，Cytc抗體：南京基美生物。SP-9001試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒：北京中杉金橋。

1.2方法

1.2.1動物模型建立 取昆明種近交系小鼠40只，分別接種1×107/ml細(xì)胞懸液于右側(cè)腋下，隨機(jī)分成四組，每組10只。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥方式 用生理鹽水溶解順鉑和PGF。接種24 h后開始給藥。給藥時間：每日早上進(jìn)行灌胃1次，晚上進(jìn)行腹腔注射1次，間隔時間12 h，連續(xù)給藥14 d。具體給藥方法見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動物的給藥種類、方式與用量

1.2.3皮下腫瘤生長實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，觀察腫瘤狀態(tài)，完整剝?nèi)∧[瘤后測量移植瘤質(zhì)量和體積。平均瘤體積=(a × b2)/ 2 (a、 b分別為腫瘤長徑和短徑)。q 值= E(A+ B )/ EA + EB(1-EA)〔EA、 EB 、 E(A+ B)分別為PGF組、 順鉑組及聯(lián)合組的抑瘤率〕根據(jù)q值判斷聯(lián)合用藥的療效，q<0.85為拮抗，q值0.85～1.15為相加，q>1.15為協(xié)同。

1.2.4Caspase-3、Caspase-8、Cytc表達(dá)檢測 采用SP法進(jìn)行免疫組化操作。分別觀察制片后的Caspase-3、Caspase-8、Cytc表達(dá)，Caspase-3為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)著色，Caspase-8和Cytc為細(xì)胞漿著色，著色成棕黃色或褐色的是陽性細(xì)胞。顯微鏡下選取每個區(qū)域不重復(fù)隨機(jī)10個高倍視野(×400)，觀察所選擇視野中的所有細(xì)胞，記錄陽性染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)并計(jì)分。

評分標(biāo)準(zhǔn)如下：IHS=A×B。A為陽性細(xì)胞數(shù)分級0～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4；B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強(qiáng)陽性)。對所得數(shù)值進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)兩樣本均數(shù)比較t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1皮下腫瘤生長實(shí)驗(yàn) 接種后，小鼠成瘤率100% ，在第1～3天，各組移植瘤生長情況基本相同；第4～14天，對照組移植瘤生長快于其他組，聯(lián)合組腫瘤生長最慢；解剖可見腫瘤質(zhì)硬，表面有血管生長分布。從平均瘤塊體積來看，用藥組瘤塊體積低于對照組(P<0.05，P<0.01)；與聯(lián)合組比較，PGF組、順鉑組均有差異(P<0.05)，而對照組有顯著性差異(P<0.01)。各組平均瘤塊體積、瘤質(zhì)量及抑瘤率，見表2。

表2 各組平均瘤質(zhì)量及瘤塊體積

2.2單獨(dú)及聯(lián)合治療對H22肝癌移植瘤細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Cytc表達(dá)影響 見表3。與對照組比較，順鉑組與PGF組Caspase-3，Caspase-8，Cytc的陽性率差別有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)；與聯(lián)合組比較，對照組差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，各單藥組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 小鼠移植瘤Caspase-3，Caspase-8，Cytc蛋白表達(dá)

3 討 論

順鉑是目前臨床上治療腫瘤最常用和較有效的化療藥物之一，大量或較長期使用，容易產(chǎn)生毒副作用、多藥耐藥性。本研究表明PGF和順鉑聯(lián)合體內(nèi)抗腫瘤具有相加作用，說明PGF可通過增加順鉑對癌細(xì)胞的敏感性而增強(qiáng)抗癌作用。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素很多，這些因素都需要激活不同的Caspase家族成員，才能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，故Caspase被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的核心執(zhí)行者即凋亡的共同通路〔3，4〕。Caspase-3屬于效應(yīng)Caspase〔5〕,是多數(shù)細(xì)胞凋亡途徑中的末端效應(yīng)蛋白酶。Caspase-8是死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中關(guān)鍵的啟動因子，細(xì)胞凋亡依賴一類對Caspase產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)，能夠通過自身切割活化，激活下游Caspase，產(chǎn)生凋亡效應(yīng)〔6，7〕。Cytc是一種可溶性多肽，定位于膜間隙，并與線粒體內(nèi)膜疏松結(jié)合。近來，有一系列的研究表明，Cytc是通過和dATP與Apaf1及Caspase-9結(jié)合，從而活化Caspase-3而起作用〔8〕。

綜上，順鉑、PGF、聯(lián)合組既通過死亡受體途徑又通過線粒體途徑誘導(dǎo)H22腫瘤細(xì)胞凋亡，且PGF可通過增加順鉑對癌細(xì)胞的敏感性而增強(qiáng)抗癌作用。

4 參考文獻(xiàn)

1杜景衛(wèi)，夏作理，李清初，等.灰樹花多糖抗S180肉瘤的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005；25(2):195-7.

2呂冬霞，杜 偉,范曉艷,等.灰樹花多糖聯(lián)合順鉑對H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011；34(3):72.

3Bradham CA,Qian T,Streetz K,etal.The mitochondrial permeability transition is required for tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis and cytochrome C release〔J〕.Mol Cell Biol,1998；18(11):6353-64.

4Rao RV,Hermel E.Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program.Mechanism of caspase activation〔J〕.J Biol Chem,2001；276(36):33869-74.

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