王玲玲 吳 雷 孫博謙

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 吉林 132001)

隨著2型糖尿病(T2DM)發(fā)病率的逐年攀升，且因長期進(jìn)行胰島素皮下注射給患者帶來的負(fù)擔(dān)，口服胰島素的研發(fā)成為目前一項(xiàng)新的研究熱點(diǎn)。本課題組受中醫(yī)治消渴組方啟發(fā)，確定了蠶蛾的抗糖尿病(DM)作用。經(jīng)前期研究結(jié)果推測蠶蛾可能是通過家蠶素Ⅱ(BbxⅡ)發(fā)揮其抗DM作用。為進(jìn)一步明確BbxⅡ?qū)Σ溉榧?xì)胞的胰島素樣作用，本研究應(yīng)用穩(wěn)定表達(dá)BbxⅡ基因的人肝細(xì)胞株(HepG2)細(xì)胞，在體外觀察BbxⅡ?qū)epG2細(xì)胞的胰島素樣作用，為明確BbxⅡ?qū)Σ溉閯游锛?xì)胞的降糖作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His質(zhì)粒 HepG2細(xì)胞株，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒 HepG2細(xì)胞株、未進(jìn)行轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞株及人胰島素均由中日聯(lián)誼醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。高糖DMEM、無酚紅1640培養(yǎng)液、優(yōu)質(zhì)胎牛血清、胰酶均由美國GIBCO公司購入?？笻is-tag小鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠購自中國碧云天生物技術(shù)公司。葡萄糖測定試劑盒、糖原染液試劑盒購自北京天根生物技術(shù)公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 (1)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞中重組Bbx(MBbxⅡ)蛋白表達(dá)。(2)葡萄糖氧化酶-過氧化物酶(GOD-POD)法測定葡萄糖消耗：①制單細(xì)胞懸液，按1×104/孔分別種植于96孔板，每組細(xì)胞設(shè)5復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)分組：A組： pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His HepG2，B組：空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)HepG2，C組：未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞， D組：10 nmol/L人胰島素作用HepG2細(xì)胞，E組：100 nmol/L人胰島素作用HepG2細(xì)胞。孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁達(dá)80%融合后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前24 h開始，細(xì)胞培養(yǎng)液更換為不含酚紅1640培養(yǎng)液，其他成分不變。實(shí)驗(yàn)開始時D組及E組加入相應(yīng)的人胰島素，作用24 h及48 h。②葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)步驟：每孔分別取細(xì)胞培養(yǎng)液2 μl，與工作液100 μl混合均勻，置于新96孔板中。設(shè)校準(zhǔn)對照孔(陽性對照)及空白對照孔(陰性對照)。37℃，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min。取出96孔板,使用酶聯(lián)免疫分析儀在505 nm波長處讀取各孔吸光度值；計(jì)算葡萄糖濃度。(3)PAS染色方法測定細(xì)胞糖原合成：①實(shí)驗(yàn)分組：A組： pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His HepG2；B組：空質(zhì)粒pcDNA3.1(+) HepG2；C組：未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞；D組：10 nmol/L人胰島素作用HepG2細(xì)胞；E組：100 nmol/L人胰島素作用HepG2細(xì)胞。②24孔板中放置高壓滅菌的蓋玻片，按2×104個/孔均勻接種細(xì)胞，每孔加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液并保持G418相應(yīng)濃度，37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合達(dá)90%以上時進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)日D組、E組HepG2細(xì)胞分別加入相應(yīng)濃度人胰島素作用，37℃，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。③細(xì)胞糖原染色實(shí)驗(yàn)步驟：0.1 mol/L磷酶鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，加入固定液10 min，水洗1 min，晾干；試劑一全部覆蓋整個蓋玻片，室溫避光孵育10 min；取出蓋玻片緩慢沖洗3 min；玻片未干之前，滴加試劑二于蓋玻片樣本上，覆蓋樣本，室溫孵育15 min；取出蓋玻片，緩慢沖洗60 s，自然晾干；滴加試劑三染色30 s，流水沖凈、晾干；中性樹膠封片，高倍鏡鏡檢。

2 結(jié) 果

2.1免疫細(xì)胞化學(xué)檢測MBbxⅡ基因在HepG2蛋白水平的表達(dá)結(jié)果 以細(xì)胞內(nèi)已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BbxⅡ基因所含有的6個his-tag為抗原，對三組HepG2細(xì)胞分別進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，結(jié)果顯示：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His組HepG2細(xì)胞胞漿中可以見到棕黃色的顆粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)組及未轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞胞漿中未見到。結(jié)果說明pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞中得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并可實(shí)現(xiàn)表達(dá)。見圖1。

A：基因未轉(zhuǎn)染組； B：pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒穩(wěn)；C：pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His組定轉(zhuǎn)染組

2.2MBbxⅡ基因?qū)epG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響 培養(yǎng)細(xì)胞換液24 h后檢測葡萄糖消耗情況，與基因未轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞比較pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His- HepG2組及100 nmol/L胰島素作用HepG2細(xì)胞組，葡萄糖消耗增多，差異有顯著性(P<0.01)。與基因未轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞比較10nM胰島素作用HepG2細(xì)胞組，差異顯著(P<0.05)。pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His- HepG2組、10 nmol/L及100 nmol/L胰島素作用HepG2細(xì)胞組進(jìn)行兩兩比較，無顯著性差異(P>0.05)。

培養(yǎng)細(xì)胞換液48 h后檢測葡萄糖消耗情況，與基因未轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞比較pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His- HepG2組及100 nmol/L胰島素作用HepG2細(xì)胞組，差異顯著(P<0.01)。與基因未轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞比較10 nmol/L胰島素作用HepG2細(xì)胞組，差異顯著(P<0.05)。pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His- HepG2組與100 nmol/L胰島素作用HepG2細(xì)胞組進(jìn)行比較，無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 MBbxⅡ基因?qū)epG2細(xì)胞葡萄糖攝取影響

2.3MBbxⅡ基因?qū)epG2細(xì)胞糖原合成作用的影響 與正常組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HepG2組比較，pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His- HepG2組及100 nmol/L胰島素作用組HepG2細(xì)胞的糖原合成均有增加(P<0.01)。與正常組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HepG2組比較，10 nmol/L胰島素作用組HepG2細(xì)胞的糖原合成增加(P<0.05)。而pcDNA3.1(+)-BbxⅡ/His- HepG2組及100 nmol/L胰島素作用組間比較無顯著性差異(P>0.05)。見圖2，表2。

表2 MBbxⅡ?qū)epG2細(xì)胞糖原合成的影響(n=30,n/n)

圖2 MBbxⅡ?qū)epG2細(xì)胞糖原合成的影響(PAS染色，400×)

3 討 論

在人類胰島素調(diào)節(jié)血糖的過程中，肝臟是最重要的靶器官。肝臟通過控制糖原的合成與分解，控制著糖異生等途徑，維持血糖的穩(wěn)定。葡萄糖攝取及糖原合成是研究肝細(xì)胞糖代謝中最重要的兩個指標(biāo)〔1，2〕。HepG2細(xì)胞是一種肝癌細(xì)胞株，常作為體外研究肝細(xì)胞糖代謝的細(xì)胞模型〔3，4〕。檢測葡萄糖消耗的方法有：3H標(biāo)記 2- DOG攝取試驗(yàn)、放射性核素14C標(biāo)記葡萄糖摻合試驗(yàn)及14C標(biāo)記葡萄糖合成糖原試驗(yàn)等。這些方法雖都能反映糖代謝的動態(tài)變化過程，并且靈敏度較高，但均存在放射線侵害，易污染環(huán)境，價格昂貴，需要特定儀器及場地等缺點(diǎn)。本研究說明MBbxⅡ具有促進(jìn)肝細(xì)胞葡萄糖攝取能力但其作用可能是快速反應(yīng)并且在短期內(nèi)滅活，這與近期關(guān)于家蠶素的一項(xiàng)研究結(jié)果相一致〔5〕。

肝臟細(xì)胞糖代謝的另外一個重要的功能是合成與存貯糖原。本研究在上述實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用糖原染色檢測MBbxⅡ?qū)epG2細(xì)胞的糖原合成調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果從另一方面證實(shí)了MBbxⅡ具有調(diào)節(jié)肝細(xì)胞糖代謝的功能。

胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一可降低血糖的激素，也是唯一同時可促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。胰島素除了對糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝起調(diào)節(jié)作用外，還可刺激DNA及蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)細(xì)胞生長。MBbxⅡ作為胰島素家族成員，是否存在促進(jìn)細(xì)胞增殖能力仍未明確。從昆蟲遺傳學(xué)角度研究發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)造血器官細(xì)胞增殖〔6，7〕以及卵巢發(fā)育〔8～10〕等生理功能。但關(guān)于MBbxⅡ?qū)Σ溉閯游锛?xì)胞是否具有同樣的促進(jìn)細(xì)胞增殖能力未見報道。

4 參考文獻(xiàn)

1Tudhope SJ，Wang CC，Petrie JL,etal.A novel mechanism for regulating hepatic glycogen synthesis involving serotonin and cyclin-dependent kinase-5〔J〕.Diabetes,2012；61(1):49-60.

2Sumenkova DV，Knyazev RA，Guschya RS,etal.Effect of apolipoprotein a-I complex with tetrahydrocortisone on protein biosynthesis and glucose absorption by rat hepatocytes〔J〕.Bull Exp Biol Med,2009；148(2):207-9.

3Wang ZB，Zeng HC，Wei HS,etal.NO-1886 ameliorates glycogen metabolism in insulin-resistant HepG2 cells by GSK-3β signalling〔J〕.J Pharm Pharmacol,2012；64(2):293-301.

4Ong LC，Jin Y，Song IC,etal.2-〔18F〕-2-deoxy-D-glucose (FDG) uptake in human tumor cells is related to the expression of GLUT-1 and hexokinase Ⅱ〔J〕.Acta Radiol,2008；49(10):1145-53.

5Loeb MJ.Factors affecting proliferation and differentiation of Lepidopteran midgut stem cells〔J〕.Arch Insect Biochem Physiol，2010;74(1):1-16.

6Suzuki A,Nagasawa H,Kataoka H,etal.Isolation and characterization of prothoracicotropic hormone from silkworm，Bombyx mori〔J〕.Agric Biol Chem，1982；46(4):1107-9.

7李洪霞，杜珍武，張玉成,等.家蠶素Ⅱ基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2011；15(1):20-2.

8李洪霞，杜珍武，張玉成，等.家蠶素Ⅱ基因在293FT細(xì)胞中的表達(dá)〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011；31(4)：634-6.

9李紅霞.基因工程重組家蠶素Ⅱ的表達(dá)及其胰島素樣作用的研究〔D〕.吉林大學(xué)博士研究生論文，2011.

10孔祥賓,徐世清.家蠶類胰島素肽的結(jié)構(gòu)及信號傳導(dǎo)與作用〔J〕.蠶業(yè)科學(xué),2010；36(3)：458-64.