任偉民 張友元 董軍明 羅金芳 賀國慶 顧立新

(復旦大學附屬金山醫(yī)院病理科，上海 201508)

乳腺癌尤其是浸潤性導管癌是老年女性常見的惡性腫瘤之一〔1〕，發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌預后相對較差，治療效果不夠滿意。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3(FoxP3)是調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)的特異性標記之一〔2〕，后者與乳腺癌密切相關(guān)，同時FoxP3作為轉(zhuǎn)錄因子本身亦發(fā)揮重要作用。本實驗通過檢測FoxP3蛋白在老年乳腺浸潤性導管癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達來探討其意義。

1 材料與方法

1.1標本 選取復旦大學附屬金山醫(yī)院病理科2009年1月至2011年12月外科手術(shù)切除的老年乳腺癌標本存檔蠟塊75例，所有病例均經(jīng)病理切片證實為乳腺浸潤性導管癌非特殊類型，診斷標準嚴格按照WHO2003乳腺癌的分類且腋下淋巴結(jié)檢出數(shù)≥15枚〔3〕，所有病例均為女性，其中老年組(年齡>60歲)28例，平均年齡〔68.92±7.02(60～85)〕歲，11例伴腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；老年前期組(>45歲，≤60歲)32例，平均年齡〔53.15±3.84(45～58)〕歲，9例伴腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；青年期組(≤45歲)15例，平均年齡〔39.69±4.10(29～44)〕歲，5例伴腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.2試劑 鼠抗人FoxP3單克隆抗體(Santa Cruz公司，1∶50稀釋)，HRP標記二抗、(DAB)顯色液、檸檬酸緩沖修復液(pH6.0)(均購自福州邁新生物技術(shù)公司)。

1.3方法 采用免疫組化EnVision兩步法，按照試劑盒規(guī)定步驟進行操作：常規(guī)石蠟切片脫蠟至水，3%過氧化氫3 min，檸檬酸緩沖液熱修復30 min，滴加一抗后4℃過夜，滴加二抗30 min，(DAB)顯色，所有步驟間均PBS沖洗，蘇木素襯染，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，以試劑盒的陽性圖片為陽性對照。

1.4結(jié)果判斷 FoxP3定位于Treg細胞的細胞核和癌細胞的細胞質(zhì)或細胞核，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。采用免疫組化分數(shù)進行半定量分析〔4〕。每張切片觀察10個高倍視野，分別給予陽性評分。 癌細胞：按染色強度分為0分(無染色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)和3分(棕褐色)；按染色比例分為0分(<5%)、1分(5%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(>75%)。兩者分數(shù)相加計算總分，≤6為低表達，>6為高表達。 FoxP3+淋巴細胞(Treg)評分：0分，無陽性細胞；1分，≤3個視野，每視野1～3個陽性細胞；2分，>3個視野，每視野1～3個陽性細胞；3分，>3個視野，每視野>3個陽性細胞。0分和1分為低表達，2分和3分為高表達。

1.5統(tǒng)計學方法 采用Stata8.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采取χ2檢驗及Fisher精確概率法，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1不同年齡組乳腺浸潤性導管癌癌組織中FoxP3的表達 三個年齡組相比較，癌組織FoxP3和癌周FoxP3+淋巴細胞總體表達有差異(P<0.05)，與青年組相比，老年組顯示癌組織FoxP3表達升高，同時癌周FoxP3+淋巴細胞數(shù)也高表達(P<0.05)，但相較老年前期病例組，老年組癌組織FoxP3及癌周FoxP3+淋巴細胞均與其未顯示統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

2.2不同年齡組乳腺浸潤性導管癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中FoxP3蛋白的差異表達 三個年齡組中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌細胞FoxP3表達及FoxP3+淋巴細胞數(shù)量高于相應原發(fā)灶，但老年前期及青年期組未顯示統(tǒng)計學差異，而老年組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2，圖1。

圖1 不同年齡組乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中FoxP3表達(EnVision法，×400)

2.3FoxP3表達與老年乳腺浸潤性導管癌臨床病理特征的關(guān)系 癌組織FoxP3的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Her2表達呈統(tǒng)計學正相關(guān)(P<0.05)，與ER呈負相關(guān)(P<0.05)，與組織學分級、腫瘤大小和PR未顯示統(tǒng)計學相關(guān)(P>0.05)；癌周浸潤的FoxP3+淋巴細胞與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Her2呈統(tǒng)計學正相關(guān)，與ER、PR表達呈負相關(guān)(P<0.05)，與組織學分級、腫瘤大小未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學相關(guān)(P>0.05)。見表3。

表1 乳腺浸潤性導管癌癌組織中FoxP3的表達(n)

表2 乳腺浸潤性導管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及對應原發(fā)灶中FoxP3蛋白的表達(n)

表3 FoxP3表達與老年乳腺浸潤性導管癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

3 討 論

FoxP3與Treg的分化決定和功能密切相關(guān)，最初對其研究集中在自身免疫性疾病方面，隨著研究深入，大量事實表明Treg在腫瘤免疫抑制方面發(fā)揮了重要作用。在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)Treg的存在，乳腺癌中Treg與其預后相關(guān)性也得到證實〔5〕。目前認為Treg主要分為3個亞群：CD4+Treg細胞、CD8+Treg細胞和γδ-TCR，而CD4+Treg又進一步分為自然發(fā)生的CD4+CD25+FoxP3+ Treg、抗原誘導的CD4+CD25+FoxP3+ Treg和CD4+FoxP3-Trl細胞〔6〕。乳腺癌中FoxP3+Treg增多被認為是機體對乳腺癌惡性轉(zhuǎn)化的反應，并且被作為腫瘤進展的指標〔7〕。多種因子能夠直接或間接與Treg反應而發(fā)揮功能作用，TGF通路是Treg較為重要的作用機制之一，在腫瘤進展尤其是轉(zhuǎn)移過程中極大地影響了腫瘤細胞的擴散能力。首先Treg表達細胞因子受體CCR4，受其配體CCL5、CCL17、CCL22等因子吸引聚集到腫瘤部位，激活后分泌大量TGF-β，后者通過各種途徑加速腫瘤進展，比如介導血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)高表達從而促進腫瘤血管生成〔8〕,Treg還與某些癌基因存在相互作用,如K-ras等，但具體機制尚不明確。

目前研究發(fā)現(xiàn)FoxP3還是X染色體連鎖的抑制基因，表達于多種惡性腫瘤細胞，包括乳腺癌、肺癌、腸癌、黑色素瘤等〔9〕，在乳腺癌細胞上表達的FoxP3與預后相關(guān)，尤其是乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移者〔10〕。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxP3具有多種作用影響癌細胞的生長，近期研究認為FoxP3對乳腺癌癌基因SKP2和Her2存在轉(zhuǎn)錄抑制作用〔11，12〕。盡管FoxP3通常與乳腺癌不良預后相關(guān)，但最近有研究發(fā)現(xiàn)在Her2過表達的乳腺癌亞型中，F(xiàn)oxP3陽性表達與預后較好相關(guān)，具有獨立的預后意義，其機制可能是通過抑制乳腺癌Her2的轉(zhuǎn)錄表達從而一定程度上對抗癌基因Her2的相關(guān)作用，抑制癌細胞生長，對乳腺癌發(fā)揮調(diào)節(jié)作用〔3〕，提示腫瘤本身的特性是FoxP3發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。與吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)的協(xié)同作用也是可能的促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機制〔13〕。

FoxP3促進乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的機制目前尚未明確，可能從兩方面起作用：一方面FoxP3+淋巴細胞(Treg)具有免疫抑制的作用，可通過細胞與細胞間直接接觸或通過分泌某些炎癥調(diào)節(jié)因子來間接調(diào)節(jié)，升高的Treg對機體的抗瘤免疫產(chǎn)生抑制，促進了癌組織的免疫逃避從而較容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。另一方面，乳腺癌組織表達的FoxP3可連接癌細胞表達化學因子受體CCR7和CXCR4，上調(diào)其轉(zhuǎn)錄、表達〔10〕，促進乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

國內(nèi)目前尚未針對乳腺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進行對比研究，本實驗發(fā)現(xiàn)癌組織FoxP3蛋白表達及癌周FoxP3+淋巴細胞在老年患者中均有所升高，一個可能的原因是隨著年齡增加，免疫系統(tǒng)的功能逐漸減弱，導致乳腺癌患者腫瘤免疫效能偏低下。一些國外研究顯示FoxP3+淋巴細胞與ER、PR負相關(guān)，與組織分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Her2正相關(guān)〔14，15〕，F(xiàn)oxP3的mRNA也檢測到在PR陰性或Her2陽性的乳癌中高表達〔16〕，但是否FoxP3的表達具有一定的區(qū)域人群間差異尚不明確，有待進一步的研究。相對原發(fā)灶而言，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)FoxP3+淋巴細胞(Treg)增多，預示組織局部免疫狀態(tài)的改變，同時轉(zhuǎn)移灶中癌組織本身FoxP3蛋白也表達升高，提示FoxP3可能與乳腺浸潤性導管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)，可以作為老年女性發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤性導管癌的治療靶點之一，反之，在作靶向治療時也要考慮到原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的差異性，制定合理的化療、放療方案。盡管FoxP3和FoxP3+淋巴細胞作為重要的因素影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移，但是并非單獨發(fā)揮作用，許多復雜的機制參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，將FoxP3作為影響老年乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的唯一指標而進行處置是不可取的。

4 參考文獻

1Benz CC.Impact of aging on the biology of breast cancer〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol,2008；66(1):65-74.

2Feuerer M，Hill JA，Mathis D,etal.Foxp3+ regulatory T cells：differentiation，specification，subphenotypes〔J〕.Nat Immunol,2009；10(7):689-95.

3Tavassoli FA,Devilee P.Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs.World Health Organization Classification of Tumours〔M〕.Lyon：IARC Press,2003：19-23.

4Ladoire S，Arnould L，Mignot G,etal.Presence of Foxp3 expression in tumor cells predicts better survival in HER2-overexpressing breast cancer patients treated with neoadjuvant chemotherapy〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2011；125(1):65-72.

5Bates GJ，F(xiàn)ox SB，Han C,etal.Quantification of regulatory T cells enables the identification of high-risk breast cancer patients and those at risk of late relapse〔J〕.J Clin Oncol,2006；24(34):5373-80.

6Watanabe MA，Oda JM，Amarante MK,etal.Regulatory T cells and breast cancer：implications for immunopathogenesis〔J〕.Cancer Metastasis Rev,2010；29(4):569-79.

7Gupta S，Joshi K，Wig JD,etal.Intratumoral FOXP3 expression in infiltrating breast carcinoma：its association with clinicopathologic parameters and angiogenesis〔J〕.Acta Oncol,2007；46(6):792-7.

8Wilson TJ，Nannuru KC，F(xiàn)utakuchi M,etal.Cathepsin G-mediated enhanced TGF-beta signaling promotes angiogenesis via upregulation of VEGF and MCP-1〔J〕.Cancer Lett,2010；288(2):162-9.

9Karanikas V，Speletas M，Zamanakou M,etal.Foxp3 expression in human cancer cells〔J〕.J Transl Med,2008；6:19.

10Merlo A，Casalini P，Carcangiu ML,etal.FOXP3 expression and overall survival in breast cancer〔J〕.J Clin Oncol,2009；27(11):1746-52.

11Zuo T，Liu R，Zhang H，etal.FOXP3 is a novel transcriptional repressor for the breast cancer oncogene SKP2〔J〕.J Clin Invest,2007；117(12):3765-73.

12Zuo T，Wang L，Morrison C,etal.FOXP3 is an X-linked breast cancer suppressor gene and an important repressor of the HER-2/ErbB2 oncogene〔J〕.Cell,2007；129:1275-86.

13Kodama J，Hasengaowa，Kusumoto T,etal.Association of CXCR4 and CCR7 chemokine receptor expression and lymph node metastasis in human cervical cancer〔J〕.Ann Oncol,2007；18(1):70-6.

14Mansfield AS，Heikkila PS，Vaara AT,etal.Simultaneous Foxp3 and IDO expression is associated with sentinel lymph node metastases in breast cancer〔J〕.BMC Cancer，2009；9:231.

15Liu F，Lang R，Zhao J,etal.CD8+ cytotoxic T cell and FOXP3+ regulatory T cell infiltration in relation to breast cancer survival and molecular subtypes〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2011；130(2):645-55.

16Ohara M，Yamaguchi Y，Matsuura K,etal.Possible involvement of regulatory T cells in tumor onset and progression in primary breast cancer〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2009；58(3):441-7.