彭文杰 吳賽珠 龔 勛 馬 懿 阮云軍 湯 敏 鐘元林 湯 展

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515)

血管衰老是人體衰老過程中的重要部分，在衰老過程中血管壁增厚、NO減少等形態(tài)學和分子學特性的改變使機體逐漸失去血管內(nèi)的平衡，繼而隨著衰老的進展更容易出現(xiàn)心血管疾病〔1〕。他汀類藥物除了降脂以外，還有多種其他的心血管保護作用。本研究擬觀察阿托伐他汀對大鼠動脈增齡變化的影響，探討阿托伐他汀在血管衰老過程中的作用及其心血管保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1動物與分組 雄性Wistar大鼠由南方醫(yī)科大學動物中心提供(實驗動物許可證號scxk(粵)2011-0015)。實驗動物分3組，每組8只：(1)12月齡組：喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料；(2)18月齡組：自12月齡喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料至18個月；(3)阿托伐他汀組：自12月齡喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料中添加阿托伐他汀5 mg·kg-1·d-1〔2〕，每周按體重調(diào)整阿托伐他汀鈣劑量，飼養(yǎng)至18個月。

1.2標本的制備 處死大鼠后取胸主動脈約150 mg，在37℃的PBS緩沖液中將脂肪組織剝離干凈，加入40 mmol/L、pH7.2的磷酸鉀緩沖液1.5 ml，4℃冰水中勻漿，10 000 r/min離心10 min，取上清-80℃保存。采用BCA蛋白定量法測蛋白濃度。

1.3主要試劑 超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)一抗購自Cell Signaling 公司。

1.4SOD和MDA的檢測 SOD采用Oyanagui的亞硝酸鹽形成法檢測；MDA采用硫代巴比妥酸法檢測。嚴格按試劑盒說明書操作。

1.5Western印跡法檢測eNOS的表達 各取100 μg蛋白煮沸5 min后8%(體積分數(shù))SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(minipore)，5%脫脂奶粉的封閉液(pH7.5，Tris-Cl 10 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，0.1% Tween-20)封閉2 h，加一抗(1∶1 000)4℃孵化過夜，其后用二抗孵育，洗去二抗后顯影。圖像分析儀(Image J軟件)定量測定雜交信號的吸光度，用面積×密度代表表達量，以18月齡組表達量為100%，其他各組值與18月齡組表達量的均值比較得出相對吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠主動脈中SOD活性及MDA含量比較 與12月齡組大鼠比較，18月齡組大鼠主動脈中SOD的活性降低，MDA含量升高；與18月齡大鼠比較，阿托伐他汀組大鼠主動脈中SOD的活性升高，MDA含量降低。見表1。

2.2各組大鼠主動脈中eNOS蛋白的表達 與12月齡組大鼠比較，18月齡組大鼠主動脈中eNOS的蛋白表達降低；與18月齡組大鼠比較，阿托伐他汀組大鼠eNOS蛋白表達升高。見表1，圖1。

表1 各組大鼠主動脈中SOD活性、MDA含量、eNOS蛋白水平比較

圖1 Western印跡檢測各組大鼠主動脈中eNOS蛋白表達

3 討 論

研究表明，增齡是心血管疾病的獨立危險因素，盡管增齡是一個不可避免的過程，但隨著人們對衰老的機制的認識，發(fā)現(xiàn)血管增齡性的衰老過程也并非是一個不可改變的心血管危險因素〔3，4〕。隨著血管衰老的進展，血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了改變，出現(xiàn)血管硬化和舒張功能受損〔5〕。

已有研究表明，隨著衰老的進展，大鼠主動脈氧化應(yīng)激和活性氧簇(ROS)增加〔6，7〕，過量產(chǎn)生的ROS會引起血管內(nèi)皮細胞功能異常，促進冠狀動脈疾病發(fā)生〔8〕。SOD是體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，是生物體內(nèi)防御氧化損傷的一種重要的ROS清除劑保護細胞免受自由基的損傷。MDA是ROS作用于細胞膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。MDA含量反映了機體受自由基攻擊的嚴重程度，可以作為評價機體氧化應(yīng)激程度的指標。

本研究結(jié)果顯示，阿托伐他汀可以改善大鼠增齡過程中血管的抗氧化功能和對氧自由基的清除能力。血管衰老過程中伴隨了血管內(nèi)皮功能的異常及其引起的內(nèi)皮依賴的血管舒張功能受損〔9，10〕。eNOS主要表達于血管內(nèi)皮細胞，它有維持血管張力、控制血壓、抗動脈粥樣硬化和其他多種血管保護作用。eNOS是內(nèi)皮源性NO生成的關(guān)鍵酶，內(nèi)皮源性NO對維持內(nèi)皮細胞功能的正常起著重要的作用；此外，內(nèi)皮源性NO可以抑制血小板的積聚和在血管壁上的粘附，從而起到防止血栓形成的作用；內(nèi)皮源性NO還具有抗動脈粥樣硬化作用，它可以抑制炎癥因子、活性氧簇等引起的細胞凋亡，可以抑制血管平滑肌細胞的過度增殖，這對減緩動脈粥樣硬化的進一步進展和纖維粥樣斑塊形成起了重要作用〔11〕。eNOS信號途徑的異常所致的內(nèi)皮源性NO減少則與人類血管性疾病密切相關(guān)，如心肌梗死、腦卒中、原發(fā)性高血壓及肺動脈高壓〔12〕。

已有研究表明，在糖尿病模型大鼠中，阿托伐他汀可以維持正常的內(nèi)皮功能、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)和增加eNOS表達〔13〕。本研究結(jié)果顯示，隨著增齡，大鼠血管內(nèi)皮細胞功能受損，而阿托伐他汀可以改善大鼠增齡過程中血管的內(nèi)皮細胞功能。

他汀類藥物除了降脂以外，還有多種其他的心血管保護作用，包括改善內(nèi)皮功能、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、減輕氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等作用〔14，15〕。本實驗研究表明，阿托伐他汀可以通過改善衰老過程中的血管抗氧化能力和增加eNOS蛋白表達，改善大鼠血管內(nèi)皮功能，從而延緩大鼠血管衰老的進程，發(fā)揮心血管保護作用。

4 參考文獻

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