宋志霞，郭銀鳳，周敏，張曉良

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 腎內(nèi)科，江蘇 南京 210009)

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 模型建立及分組

實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為：正常對照組(NC組，n=10)、DN組(n=10)和DN加活性維生素D3干預(yù)組(DN+VD組，n=10)3組。DN組和DN+VD組腹腔注射STZ 60 mg·kg-1。NC組腹腔注射等量的生理鹽水。STZ注射3 d后測血糖>16.7 mmol·L-1證明造模成功。DN+VD組給予活性維生素D30.1 μg·kg-1·d-1灌胃，其余兩組大鼠同時給予等體積花生油灌胃。造模成功后6、12、18周檢測大鼠血糖、體重、24 h尿蛋白量。于造模后18周末處死大鼠。處死前留取血樣本和腎組織標(biāo)本。實驗過程觀察大鼠精神狀態(tài)、活動狀況、毛發(fā)、體重及排便情況。

1.3 血尿生化指標(biāo)檢查

血糖(Glu)、血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、鈣(Ca)和磷(P)采用全自動生化分析儀測定，24 h尿蛋白量采用雙縮脲法測定。

1.4 腎臟病理學(xué)檢查

1.5 免疫組化檢測

石蠟切片脫蠟水化，微波修復(fù)抗原，采用SP法免疫組化試劑盒，檢測指標(biāo)包括Podocin、Nephrin和Desmin(1∶200稀釋)，DAB顯色2～5 min，顯微鏡下觀察，控制著色時間，蘇木素復(fù)染，所有操作按照說明書進(jìn)行。每張切片隨機(jī)選取20個連續(xù)不重復(fù)視野(400倍)，行半定量分析：無染色(-)，輕度染色(淡黃色，+)，中度染色(棕黃色，++)，重度染色(棕褐色，+++)。參照免疫組化反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)(1996)進(jìn)行評分。

1.6 免疫熒光觀察

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況

NC組大鼠精神狀況良好，毛皮有光澤，反應(yīng)靈敏，活動自如；DN組大鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動倦怠，毛發(fā)雜亂泛黃無光澤，有脫毛現(xiàn)象，尿量多(每天更換墊料1次)，體重下降明顯；DN+VD組大鼠精神狀態(tài)較好，反應(yīng)較靈敏，毛色可，尿量多，體重較DN組無差異。

2.2 各組大鼠體重及血、尿指標(biāo)變化

見表1、2。造模成功6～18周，DN組及DN+VD組與NC組相比體重均有所下降，尿蛋白量增多，但是DN+VD組在12周以后尿蛋白的量及腎質(zhì)量體重比(KW/BW)明顯低于DN組。造模18周后，血腎功能指標(biāo)以及鈣、磷等指標(biāo)3組間無差異。

組 別體重/g造模前造模后6周造模后12周造模后18周尿蛋白/mg·(24 h)-1造模前造模后6周造模后12周造模后18周NC組256.14±6.20408.29±27.40527.14±45.32551.00±49.368.83±2.319.71±2.897.62±2.308.91±2.01DN組251.18±13.48235.50±33.53a268.86±57.20a267.17±77.73a7.95±1.8047.55±5.02a54.21±12.64a64.49±4.64aDN+VD組254.71±22.91237.87±34.45a268.20±60.27a250.80±44.24a8.70±3.0136.88±9.74a42.59±7.36ab41.16±3.44ab

a 與NC組比較，P<0.05； b 與DN組比較，P<0.05

組 別KW∶BW/g·kg-1Glu/mmol·L-1BUN/mmol·L-1Scr/μmol·L-1Ca/mmol·L-1P/mmol·L-1NC組2.98±0.135.93±0.546.65±0.4249.87±2.562.56±0.432.52±0.21DN組5.43±0.53a27.89±3.12a9.97±2.4352.22±8.212.62±0.222.48±0.23DN+VD組3.65±0.63ab27.47±3.32a9.78±0.4954.03±2.642.70±0.342.38±0.27

a 與NC組比較，P<0.05； b 與DN組比較，P<0.05

2.3 腎組織病理學(xué)改變

PAS染色結(jié)果顯示，DN組腎小球肥大伴系膜基質(zhì)增生明顯，DN+VD組腎小球肥大及系膜基質(zhì)增生程度均較DN組輕(均P<0.05)；Masson染色3組之間慢性化損傷指標(biāo)未見差異；電鏡下顯示，DN組腎小球基底膜增厚，足突融合(箭頭所示)，活性維生素D3干預(yù)后的DN+VD組上述病變明顯減輕。見圖1。

a 與NC組比較，P<0.05； b 與DN組比較，P<0.05；n=5

圖1各組大鼠腎臟組織病理學(xué)改變PAS、Masson×400

Fig1Thechangesofkidneypathologyinthreegroups(PAS,Masson×400)

2.4 活性維生素D3對腎臟足細(xì)胞裂隙隔膜蛋白的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示，NC組大鼠大量表達(dá)足細(xì)胞裂隙隔膜蛋白Podocin以及Nephrin，而DM大鼠表達(dá)明顯減少。免疫組化半定量分析以及蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，活性維生素D3干預(yù)后的DN+VD組Podocin及Nephrin表達(dá)量均高于DN組(P<0.05)，但是仍低于NC組(P<0.05)，見圖2、3。

2.5 足細(xì)胞損傷標(biāo)志Desmin表達(dá)的變化

NC組大鼠腎臟幾乎不表達(dá)或低表達(dá)Desmin，而DM大鼠腎臟Desmin的表達(dá)明顯增加(P<0.05)，但活性維生素D3干預(yù)后的DN+VD組Desmin的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖2、3。

2.6 腎組織中TRPC6的蛋白表達(dá)

免疫熒光及蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，NC組大鼠腎臟幾乎不表達(dá)或低表達(dá)TRPC6，而DM大鼠腎臟TRPC6的表達(dá)明顯增加(P<0.05),活性維生素D3干預(yù)后的DN+VD組TRPC6的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖3、4。

a 與NC組比較，P<0.05；b 與DN組比較，P<0.05；n=5

圖2各組大鼠腎組織Podocin、Nephrin、Desmin的表達(dá)及其半定量結(jié)果免疫組化×400

Fig2Theexpressionchangesofpodocin,nephrinanddesminandsemiquantitativeanalysisinrenalineachgroup(Immunohistochemicalstaining×400)

2.7 TRPC6與24 h尿蛋白、Podocin、Nephrin及Desmin的相關(guān)性

TRPC6與Podocin(r=-0.808、P<0.05)、Nephrin(r=-0.791，P<0.05)呈負(fù)相關(guān)，而與24 h尿蛋白(r=0.886，P<0.05)、Desmin(r=0.929，P<0.05)呈正相關(guān)，見圖5。

3 討 論

最近研究發(fā)現(xiàn)，腎小球足細(xì)胞損傷是DN早期的重要分子病理特征[7]，但是其損傷的具體機(jī)制目前并不是十分清楚。近10余年，隨著對足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白的發(fā)現(xiàn)及深入研究，對蛋白尿的發(fā)生提出了新的學(xué)說。腎小球疾病時可以引起足突融合、裂孔隔膜蛋白如Podocin及Nephrin表達(dá)異常，進(jìn)而導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能障礙，產(chǎn)生蛋白尿。Nephrin是特異表達(dá)在足細(xì)胞裂孔隔膜處的一種跨膜蛋白。以往大量臨床及動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，DM狀態(tài)下腎臟中Nephrin表達(dá)下降，且與尿蛋白呈負(fù)相關(guān)。Nephrin與其他裂隙隔膜蛋白Podocin、CD2AP共定位，以三聚體的形式參與重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。Desmin是一種細(xì)胞骨架中間絲蛋白，正常情況下僅在系膜細(xì)胞少量表達(dá)，足細(xì)胞不表達(dá)，當(dāng)足細(xì)胞受損時，可大量表達(dá)[9]，因此可作為反映足細(xì)胞損傷的標(biāo)志蛋白。足細(xì)胞上特異蛋白的表達(dá)異常是反映其損傷的標(biāo)志。本實驗DN模型PAS染色僅觀察到系膜基質(zhì)的增多及腎小球的肥大，Masson染色3組之間沒有差異，進(jìn)一步證實了該模型在此階段處于疾病的早期階段。本研究同時發(fā)現(xiàn)，STZ誘導(dǎo)的DM大鼠足細(xì)胞Nephrin和Podocin的蛋白表達(dá)水平均明顯下降，而Desmin表達(dá)顯著增加(圖2、3)。這一結(jié)果提示DM大鼠存在足細(xì)胞的損傷，與以往的研究結(jié)果一致，但是其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。

a 與NC組比較，P<0.05； b 與DN組比較，P<0.05；n=5

圖3各組大鼠腎組織Podocin、Nephrin、Desmin和TRPC6的表達(dá)及其半定量分析

Fig3Theexpressionchangesofpodocin,nephrin,desminandTRPC6andsemiquantitativeanalysisinrenalineachgroup

圖4各組大鼠腎組織TRPC6的表達(dá)免疫熒光×400

Fig4TheexpressionchangeofTRPC6inrenalineachgroup(Immunofluorescenstaining×400)

圖5TRPC6與24h尿蛋白定量、Podocin、Nephrin和Desmin相關(guān)性分析

Fig5CorrelationbetweenTRPC6and24hurinaryprotein,nephrin,podocin,anddesmininSTZrats

綜上所述，本研究在STZ誘導(dǎo)的DN大鼠模型中證實，維生素D3顯著抑制STZ誘導(dǎo)的DN大鼠腎臟損傷，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)TRPC6的表達(dá)有關(guān)。本研究成果將為活性維生素D3防治DN足細(xì)胞損傷的研究提供實驗證據(jù)。