呂 洋 李鳳玉 任君旭 劉 博

(河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，河北 張家口 075000)

人組織激肽釋放酶家族(KLKs)是胰凝乳蛋白酶家族絲氨酸蛋白酶的亞家族，廣泛存在于人體多種生理組織和體液中。KLK6及KLK10均是KLKs的成員。近來研究發(fā)現(xiàn)，KLK6及KLK10參與包括結(jié)直腸癌存在的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔1～4〕。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)二者在結(jié)直腸腺癌、腺瘤和正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)，回顧性研究KLKs與結(jié)直腸癌臨床病理的關(guān)系及可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 采用隨機(jī)法從河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科2008年1月1日至2011年12月31日手術(shù)切除原發(fā)性結(jié)直腸腺癌437例石蠟包埋標(biāo)本中選取57例，所有患者術(shù)前均未經(jīng)過任何治療且均有完整的臨床病理資料。入選病例有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明確，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例要求送檢淋巴結(jié)數(shù)目≥12枚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例至少有1枚淋巴結(jié)被病理證實(shí)有癌轉(zhuǎn)移。同時(shí)選取結(jié)直腸腺瘤石蠟標(biāo)本21例，距癌組織>5 cm的正常黏膜組織共11例作為對(duì)照，對(duì)照標(biāo)本經(jīng)病理證實(shí)無腫瘤細(xì)胞浸潤，無明顯炎癥，無明顯細(xì)胞增生等病變。57例結(jié)直腸癌標(biāo)本中，男33例，女24例，年齡22～78歲，中位年齡56.0為，平均年齡為55.2歲。腫瘤直徑≤5 cm的31例(54.4%)，>5 cm的26例(45.6%)；分化程度為高分化的14例，中分化22例，低分化21例；TNM分期為Ⅰ期的5例，Ⅱ期17例，Ⅲ期22例；Ⅳ期13例。

1.2試劑及方法 兔抗人KLK6多克隆抗體(工作濃度為1∶100)、兔抗人KLK10多克隆抗體(工作濃度為1∶200)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；S-P試劑盒、檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液、 PBS緩沖液、抗體稀釋液、DAB顯色劑均購自石家莊勃盛化學(xué)試劑有限公司。按照S-P免疫組化檢測(cè)試劑盒中的操作方法并用高壓鍋抗原修復(fù)技術(shù)檢測(cè)KLK6及KLK10在結(jié)直腸癌中的表達(dá)。PBS 緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3結(jié)果判斷 KLK6及KLK10的蛋白陽性產(chǎn)物均主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。出現(xiàn)灰黃色、金黃色或棕黃色顆粒記為陽性細(xì)胞，依陽性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞的百分比及著色強(qiáng)度綜合計(jì)分〔5〕。由兩位病理醫(yī)師分別雙盲閱片，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比的平均數(shù)，按腫瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)量記為0～3分，陽性細(xì)胞數(shù)目為<10%為0分，10%～49%為1分，50%～74%為2分，≥75%為3分；著色強(qiáng)度記為0～3分，無色為0分，灰黃色為1分，金黃色為2分，棕黃色為3分；將兩項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)分相加，根據(jù)總的分?jǐn)?shù)分為2級(jí)，0～2分為陰性，≥3分為陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1KLK6及KLK10在不同結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)情況 與陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，KLK6及KLK10在正常結(jié)直腸黏膜組織中多呈陰性表達(dá)，在腺瘤組織中表達(dá)增強(qiáng)，在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)明顯(圖1)。KLK6及KLK10在結(jié)直腸腺癌的陽性率分別為52.6%和66.7%，在結(jié)直腸腺瘤的陽性率分別為33.3%和38.1%，在正常結(jié)直腸黏膜組織中的陽性率為9.1%和27.3%。KLK6及KLK10在結(jié)直腸腺癌、結(jié)直腸腺瘤及正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)均具有顯著差異(χ2=8.129和8.978，P均<0.05)。見表1。

2.2KLK6及KLK10的表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 見表2。KLK6及KLK10的表達(dá)均與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P均<0.05)。TNM分期高、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移的患者KLK6及KLK10的表達(dá)均強(qiáng)。此外，KLK6還與腫瘤的分化程度相關(guān)，低分化的結(jié)直腸癌KLK6蛋白表達(dá)高(P=0.015)。而KLK6及KLK10的陽性表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小等均不相關(guān)(P均>0.05)。

正常結(jié)直腸黏膜KLK6

結(jié)直腸腺瘤KLK6

結(jié)直腸腺癌KLK6

陰性對(duì)照組

正常結(jié)直腸黏膜KLK10

結(jié)直腸腺瘤KLK10

結(jié)直腸腺癌KLK10

圖1各種結(jié)直腸黏膜組織KLK6、KLK10表達(dá)(SP，×200)

表1 KLK6和KLK10在結(jié)直腸腺癌、腺瘤和正常黏膜組織中的表達(dá)〔n(%)〕

表2 KLK6和KLK10陽性表達(dá)與臨床病理情況的關(guān)系

2.3KLK6及KLK10在結(jié)直腸癌表達(dá)的相互關(guān)系 KLK6及KLK10在結(jié)直腸癌的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.745)。KLK10在KLK6陽性組中的表達(dá)(陽性率100%)明顯高于在KLK6陰性組中的表達(dá)(陽性率29.6%)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，KLKs參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，主要方式為通過其編碼的hK蛋白直接或間接的降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如膠原蛋白，纖連黏連蛋白，層黏連蛋白等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、腫瘤新生血管的形成。

KLK6基因是KLKs成員之一，編碼由223個(gè)氨基酸組成、具有胰蛋白酶樣活性的hK6蛋白。國外學(xué)者通過EST數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)KLK6在女性生殖系統(tǒng)如卵巢、子宮和消化系統(tǒng)如食管、胃、胰腺等腫瘤中表達(dá)上調(diào)，在乳腺和腦部腫瘤中表達(dá)下調(diào)〔6〕。關(guān)于KLK6與結(jié)直腸癌的研究，Ogawa等〔7〕采用RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中 KLK6 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常組織， KLK6 mRNA高表達(dá)與腫瘤漿膜浸潤、肝轉(zhuǎn)移、臨床分期、預(yù)后差相關(guān)。Kim等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)， KLK6 mRNA在結(jié)直腸癌患者組織及血清中的表達(dá)水平顯著增高，且與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，KLK6在結(jié)直腸腺癌、結(jié)直腸腺瘤及正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)具有顯著差異。進(jìn)一步與臨床病理的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，KLK6的表達(dá)與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移情況及腫瘤的分化程度相關(guān)。分化程度低、TNM分期高、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移的患者KLK6的表達(dá)均強(qiáng)，這一結(jié)果與Petraki等〔9〕的結(jié)果一致。

KLK10基因位于19號(hào)染色體q13.4位置上， 含6個(gè)外顯子(其中一個(gè)未被翻譯)和5個(gè)內(nèi)含子，編碼一條分子量約為30 kD的含276 個(gè)氨基酸的蛋白。近年大量研究顯示，在激素相關(guān)性組織發(fā)生的腫瘤如乳腺癌、前列腺、睪丸癌中KLK10 表達(dá)異常，多數(shù)病例表達(dá)下降，也有少數(shù)表達(dá)異常升高，高表達(dá)則提示預(yù)后不良〔10〕。KLK10在激素相關(guān)性組織發(fā)生的腫瘤中異常表達(dá)可能與性激素分泌失衡相關(guān)〔11〕。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)KLK10在結(jié)直腸癌中也呈異常高表達(dá)，且與結(jié)直腸癌患者的腫瘤分期及肝臟轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔12，13〕。本研究結(jié)果顯示，KLK10在結(jié)直腸腺癌、腺瘤及正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)具有顯著性差異。伴有淋巴結(jié)及肝臟轉(zhuǎn)移、TNM分期越高的患者KLK10的表達(dá)越強(qiáng)。而KLK10陽性表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度等均不相關(guān)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，KLK6及KLK10基因在多種腫瘤中表達(dá)結(jié)果相一致，如在前列腺癌中KLK6及KLK10的表達(dá)均下調(diào)〔14〕，在卵巢癌組織中二者則均呈過表達(dá)〔15〕。在乳腺癌和淋巴細(xì)胞白血病中KLK6及KLK10的表達(dá)異常均是由于二者高度甲基化的CpG島引起的〔16〕。本研究結(jié)果也顯示，KLK6及KLK10在結(jié)直腸癌的表達(dá)呈正相關(guān)，KLK10在KLK6陽性組中的表達(dá)率明顯高于在KLK6陰性組中的表達(dá)率。由此推測(cè)在KLKs中，KLK6及KLK10在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起到了協(xié)同作用，但具體機(jī)制仍不清楚，仍需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，KLK6及KLK10參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展并與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，可作為較為理想的腫瘤標(biāo)志物輔助判斷患者預(yù)后并指導(dǎo)臨床治療。

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