嚴(yán) 麗

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腺體外科，河北 石家莊 050000)

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，占人類(lèi)所有惡性腫瘤的1%～2%〔1〕。近年來(lái)甲狀腺癌在我國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，以每年3%的增長(zhǎng)速度遞增〔2〕。隨著甲狀腺癌規(guī)范性診療指南的推廣與應(yīng)用，其復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移率和病死率有所降低〔3〕。細(xì)胞周期的調(diào)控失衡被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的共同特征，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)限制、自主的增殖和分裂〔4〕。G1/S是一重要細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)，p27是該調(diào)控點(diǎn)的一重要負(fù)性調(diào)控因子，屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，能阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。S期激酶相關(guān)蛋白(Skp)2也是細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的必需因子，能特異性地識(shí)別以p27為代表的細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，并促使其多聚泛素化及降解，使細(xì)胞周期從G1期進(jìn)展至S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖〔5〕。因此，Skp2可通過(guò)降低p27蛋白的表達(dá)，從而參與細(xì)胞周期的調(diào)控，并參與調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切〔6〕。本研究擬觀察Skp2和p27蛋白在甲狀腺癌中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2011～2013年我科首次就診的老年甲狀腺癌患者85例，納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①甲狀腺癌經(jīng)病理學(xué)確診；②未進(jìn)行過(guò)放療或化療；③無(wú)其他惡性腫瘤病史。男29例，女56例；年齡60～72歲，平均(65.42±4.82)歲；均為乳頭狀癌；腫瘤大小<2 cm 23例、2～4 cm 26例、>4 cm 36例；腫瘤TNM分期Ⅰ期28例、Ⅱ期25例、Ⅲ期21例、Ⅳ期11例；無(wú)組織侵犯53例、有周?chē)M織侵犯32例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。另外選擇同期經(jīng)病理學(xué)確診的甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫老年患者各40例,3組年齡和性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。得到本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并且患者均知情同意。

1.2主要試劑 鼠抗人Skp2蛋白多克隆抗體、鼠抗人p27蛋白多克隆抗體、胃蛋白酶抗原、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(SP)免疫組織化學(xué)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均由北京博奧森生物技術(shù)公司提供。

1.3方法 所有標(biāo)本取出后立即用10%甲醛溶液固定后常規(guī)石蠟包埋。石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3×5 min，胃蛋白酶抗原于37℃修復(fù)5 min，PBS沖洗3×5 min；3%過(guò)氧化氫處理10 min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，檸檬酸鹽緩沖液中微波抗原修復(fù)，滴加鼠非特異性免疫血清，濕盒內(nèi)室溫下孵育20 min，滴加Skp2和p27一抗，37℃孵育60 min后4℃下過(guò)夜，室溫下孵育20 min；PBS沖洗3×5 min；滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3×5 min；加DAB顯色液，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來(lái)水沖洗，PBS沖洗3×5 min；梯度乙醇脫水干燥，中性樹(shù)脂封片。

1.4結(jié)果判定 Skp2蛋白主要表達(dá)于淋巴細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。p27主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，胞質(zhì)可有少量表達(dá)，出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。根據(jù)綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率進(jìn)行平均半定量進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分：光鏡下每張切片選取5個(gè)有代表性的高倍視野(400倍)，每個(gè)高倍視野選定中央測(cè)量區(qū)作為計(jì)數(shù)區(qū)域，計(jì)算測(cè)量區(qū)內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞百分率，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。兩種評(píng)分得分相加，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～6分為中等陽(yáng)性()，>6分為強(qiáng)陽(yáng)性()〔7〕。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法 使用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組Skp2蛋白表達(dá)的比較 甲狀腺癌組Skp2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于甲狀腺瘤組和甲狀腺腫組(χ2=15.319，P=0.000；χ2=17.362，P=0.000)，甲狀腺腺瘤組和甲狀腺腫組Skp2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.056，P=0.813)，見(jiàn)圖1和表1。

2.2各組p27蛋白表達(dá)的比較 甲狀腺癌組p27蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于甲狀腺腺瘤組和甲狀腺腫組(χ2=32.663，P=0.000；χ2=33.527，P=0.000)，甲狀腺腺瘤組和甲狀腺腫組p27蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.157，P=0.692)，見(jiàn)圖1和表1。

圖1 各組Skp2、p27蛋白的表達(dá)(×400)

表1各組Skp2、p27蛋白表達(dá)的比較〔n(%)〕

與甲狀腺癌組比較：1)P<0.001

2.3Skp2蛋白在甲狀腺癌中的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 Skp2蛋白的表達(dá)與腫瘤分期、周?chē)M織侵犯情況及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05或P<0.01)，而與性別和腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.4p27蛋白在甲狀腺癌中的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 p27蛋白的表達(dá)與腫瘤分期、周?chē)M織侵犯情況及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P<0.05或P<0.01)，而與性別和腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.5甲狀腺癌組織中Skp2蛋白和p27蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 甲狀腺癌組織中Skp2與p27蛋白表達(dá)評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.657，P=0.016)。

表2 Skp2蛋白在甲狀腺癌中陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

表3 甲狀腺癌p27蛋白陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

3 討 論

甲狀腺癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，也是發(fā)病率增速最快的腫瘤〔8〕。目前我國(guó)甲狀腺癌的發(fā)病率居腫瘤發(fā)病率第10位，總發(fā)病率為4.21/10萬(wàn)，占內(nèi)分泌相關(guān)腫瘤的第一位〔9〕。甲狀腺癌最初臨床多表現(xiàn)為無(wú)痛性甲狀腺結(jié)節(jié)，最重要的生物學(xué)行為是浸潤(rùn)包膜和包膜外組織發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，容易轉(zhuǎn)移到頸部軟組織、頸部淋巴結(jié)、縱隔淋巴結(jié)等。由于甲狀腺癌復(fù)發(fā)率較高，致使其不可治愈性和死亡率增加〔10〕。隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，腫瘤已被認(rèn)為是一個(gè)多基因多信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)的復(fù)雜的分子過(guò)程，以細(xì)胞增長(zhǎng)和增殖失控為特征，表現(xiàn)為細(xì)胞周期調(diào)控的紊亂。細(xì)胞周期調(diào)定點(diǎn)以G1/S期調(diào)控檢測(cè)點(diǎn)最為重要，正調(diào)控因子可促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)調(diào)定點(diǎn)，而負(fù)調(diào)控因子則抑制細(xì)胞通過(guò)調(diào)定點(diǎn)。

Skp2是泛素連接酶復(fù)合物中DNA復(fù)制所必需的一種F-box蛋白，是細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的必需因子。Skp2能夠特異性識(shí)別第187位蘇氨酸(Thrl87)磷酸化的p27，并介導(dǎo)其多聚泛素化及降解，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)展至S期，從而導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)、惡性增生和腫瘤形成〔11〕。既往的研究結(jié)果表明，Skp2在人類(lèi)的許多癌組織如過(guò)表達(dá)，并且與腫瘤的分化程度有關(guān)〔12～15〕。在非小細(xì)胞肺癌的實(shí)驗(yàn)研究表明，Skp2與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、臨床分期及組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)〔16〕。而在鼻咽癌患者中95%以上可檢測(cè)到Skp2表達(dá)，Skp2高表達(dá)預(yù)示易向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔17〕。顯然，Skp2是一種與細(xì)胞周期有關(guān)的腫瘤原癌基因，多種腫瘤中明顯表達(dá)增高并與預(yù)后不良明顯相關(guān)〔18〕。因此，Skp2可能與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、擴(kuò)散有關(guān)。p27是一個(gè)重要的候選抑癌基因，是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白家族的重要成員，在控制細(xì)胞G1/S期檢查點(diǎn)中具有重要作用。p27基因定位于染色體12p13，由2個(gè)有編碼功能的外顯子編碼，相對(duì)分子質(zhì)量為27 000。p27作為細(xì)胞周期G1期的負(fù)向調(diào)控因子，負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，一直以來(lái)都被視為候選的抑癌基因〔19〕。p27表達(dá)缺失使腫瘤細(xì)胞容易跨過(guò)G1/S期檢查點(diǎn)從而誘導(dǎo)細(xì)胞惡性增殖，其蛋白表達(dá)水平異常及功能異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。p27低表達(dá)已被認(rèn)為與腫瘤預(yù)后不良及高侵襲性密切相關(guān)〔20〕。p27表達(dá)有3種調(diào)節(jié)機(jī)制，包括p27啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)、p27 mRNA翻譯水平調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)降解調(diào)節(jié)。經(jīng)研究〔11〕證實(shí)，p27的蛋白表達(dá)水平主要受轉(zhuǎn)錄后機(jī)制的調(diào)節(jié)，其中由Skp2介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑是p27蛋白降解的重要途徑。p27又稱激酶抑制蛋白，是KIP家族一員，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，p27基因及其產(chǎn)物主要通過(guò)細(xì)胞周期G-S節(jié)點(diǎn)的抑制來(lái)抑制細(xì)胞增殖，具有腫瘤抑制功能〔21〕；p27的異常表達(dá)與胃癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系〔22〕。本研究結(jié)果說(shuō)明Skp2蛋白在甲狀腺癌組織中高表達(dá)，而p27在甲狀腺癌組織中表達(dá)缺失，提示Skp2和p27蛋白參與甲狀腺癌的發(fā)生及發(fā)展。

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